乳清分离蛋白与单宁酸相互作用提高稻米油Pickering乳液的稳定性

李宛蓉，刘 佩，余静怡，秦新光，刘 刚

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

Pickering乳液是以固体颗粒替代传统乳化剂实现乳液体系的稳定。与小分子表面活性剂稳定的传统乳液相比，Pickering乳液中起到乳化作用的具有部分润湿性的固体颗粒安全性更高，可以不可逆地吸附和固定在油-水界面，使得乳液液滴周围形成致密的吸附层，为液滴之间的接触提供空间上的物理屏障，从而赋予Pickering乳液更强的稳定性[1-2]。近年来，有关食品级固体颗粒Pickering稳定剂的研究与开发越来越受到科研工作者们的青睐，他们通过修饰、改性、复合等多种手段，以天然蛋白质、多糖、多酚等为原材料实现了Pickering乳液的稳定。Ning Fangjian等[3]制备了一种新型双诱导花生蛋白纳米粒子用于稳定食品级Pickering乳液。Ju Mengnan等[4]成功制备了由大豆分离蛋白和花青素复合纳米颗粒稳定的Pickering乳液。Zou Yuan等[5]基于玉米醇溶蛋白和单宁酸（tannic acid，TA）在乙醇溶液中的氢键相互作用制备了新型玉米醇溶蛋白-TA复合胶体颗粒用于稳定Pickering乳液。可见，有关食品级Pickering稳定剂的研究与开发具有广阔的发展前景。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）是一种在浓缩乳清蛋白的基础上经过进一步的提取获得的蛋白质，其营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分，工业生产中，WPI大多作为乳化剂应用于食品与化妆品领域。然而，由于蛋白本身的环境敏感性，使其在某些特定的条件如高温、高盐等因素的影响下，WPI乳液的稳定性受到很大程度的影响而易氧化、不宜贮藏。因此，为了提高WPI蛋白基乳液的稳定性，通过加入TA实现乳液稳定性的改善。

TA是由五倍子中提取出的一种鞣质，是植物自身产生的次生代谢物，主要存在于水果干、生石榴、种子以及豆类植物中[6-7]，其水溶液呈酸性，见光易分解，极容易被氧化成黑色的氧化物。因TA的多元酚羟基结构，其供氢能力很强，能够有效地清除氧自由基，同时TA具有良好的生理功能，如收敛性、抗菌性、抗氧化性等[8]。稻米油是从稻米的脂肪中经过萃取、提取、分离所得到的油脂，营养价值相比其他植物油较高。本实验选用的稻米油是从米糠中提取的，也称为米糠油。米糠作为稻谷加工的主要副产物，其中含有丰富的营养成分，如谷维素、VE（生育三烯酚）、植物甾醇、油酸、亚油酸等，具有降血脂、血压、血糖，抗衰老等多重生理功效，在国际上拥有“心脏油”的美誉[9-10]。本实验选用稻米油制备Pickering乳液，以期对米糠资源的开发与利用起到一定的推广作用。

本实验通过研究WPI与TA的复合比例对WPI与TA相互作用的影响，制备出稳定且尺寸适宜的WPI-TA纳米颗粒，并利用WPI与WPI-TA纳米颗粒作为稳定剂稳定稻米油Pickering乳液，同时探究TA的加入对乳液稳定性产生的影响，以期拓展WPI与稻米油在食品领域的应用范围，开发一种新型具有潜在优势的Pickering稳定剂，同时为蛋白与多酚相互作用影响乳液稳定性提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稻米油 益海嘉里食品营销有限公司；WPI（蛋白质量分数96.88%） 美国Hilmar Ingredients公司；TA美国阿拉丁工业公司；没食子酸、2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸、1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶液、过氧化氢异丙苯溶液（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

670 傅里叶变换红外光谱仪 美国Nexus公司；FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T-18型高速分散仪 德国IKA公司；FD5-series冷冻干燥机 上海今昊科学仪器有限公司；CX40光学显微镜舜宇光学科技（集团）有限公司；Zetasizer Nano ZS马尔文激光粒度仪、MS3000激光粒度仪 英国马尔文有限公司；UV1000紫外-可见分光光度计 天美（中国）科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-TA纳米粒子的制备

参考相关文献[11]，制备WPI-TA纳米粒子。将1 g WPI溶解于100 mL的超纯水中，室温下磁力搅拌2 h待其充分溶解，使用0.1 mol/L NaOH溶液调至pH 9.0并放于4 ℃冰箱冷藏过夜备用。将一定量的TA溶于100 mL超纯水中，同样使用0.1 mol/L NaOH溶液将TA溶液pH值调至9.0。然后以1∶1的体积比将2 种溶液混合，并暴露于空气中持续搅拌24 h。反应结束后，重新调整溶液pH值为7.0，冷冻干燥备用。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱分析

采用溴化钾压片法测定蛋白的结构变化，以1∶100的质量比将TA、WPI以及WPI-TA分别与溴化钾粉末进行混合，在玛瑙研钵中研磨成均匀的粉末，压成薄片，参数设置：波数范围400～4 000 cm－1，分辨率8 cm－1，扫描次数16 次，环境温度25 ℃[12]。

1.3.3 TA对蛋白粒径与Zeta电位的影响

采用Malvern Nano-ZS型激光粒度仪对WPI-TA溶液进行粒径与Zeta电位分析。测定不同条件下乳液的粒径分布以及多分散系数。取1.3.1节中配制的WPI以及WPI-TA溶液，依次选用WPI与TA质量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的复合溶液[13-14]，测定不同条件下WPI-TA纳米粒子的粒径，优化WPI与TA的最佳结合质量比。在测量前，使用超纯水将乳液稀释100 倍，以减小多重散射对数据造成的误差。

1.3.4 扫描电子显微镜分析

用导电双面胶将样品固定在样品台上，将少许样品撒在双面胶上，吹去多余的粉末，在真空状态下喷金后置于扫描电子显微镜中观察并拍摄样品形貌照片。

1.3.5 稻米油Pickering乳液的制备

以1.3.3节优化制得的WPI-TA纳米粒子为水相，稻米油作为油相，将水相和油相两者以质量比1∶1混合在玻璃瓶中，利用高速剪切机于12 000 r/min剪切2 min，得到WPI-TA稳定的稻米油Pickering乳液，于室温下静置以便进一步分析[15]。

1.3.6 稻米油Pickering乳液的微观结构

取少量的乳液，稀释一定的倍数，取10 μL稀释后的乳液进行制片，在光学显微镜下观察乳液的外观形态，并拍照分析。

1.3.7 稻米油Pickering乳液的粒径分析

取新鲜制备的Pickering乳液，使用Mastersizer 3000激光粒度分布仪对其进行粒径分布分析。其参数为颗粒吸收率0.001，颗粒折射率1.470，分散剂折射率1.330，密度0.840 kg/m³，球形液滴。

1.3.8 稻米油Pickering乳液的Zeta电位分析

采用Malvern Nano-ZS型动态光散射分析仪对WPI-TA溶液进行Zeta电位分析。在测量前，使用超纯水将乳液稀释100 倍，以减小多重散射对数据造成的误差。

1.3.9 乳液过氧化值（peroxide value，POV）的测定

参考文献[16]的方法，将新鲜制备的乳液分装到10 mL的西林瓶中，置于50 ℃恒温培养箱中加速氧化，并于定期拿出分装小样进行氧化实验的测定。

1.3.10 乳液次级氧化物硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的测定

采用Zhao Qiang等[17]的方法，进行乳液次级氧化物TBARS的测定。取2 mL乳液于10 mL的离心管中，并加入以1∶1混合的三氯乙酸和硫代巴比妥酸的混合液4 mL，摇匀，使其完全反应，将离心管放置在95 ℃水浴锅中恒温水浴15 min，快速冷却至室温，8 000 r/min离心20 min，离心后静置10 min，并于波长532 nm处测其吸光度，根据1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准曲线进行计算。

1.3.11 乳液的热稳定性测定

将使用WPI以及WPI-TA纳米颗粒新鲜制备的Pickering乳液分别置于室温、50 ℃以及85 ℃条件下水浴加热30 min，冷却至室温后，通过光学显微镜观察其乳滴形态的变化。

1.3.12 乳液的盐离子稳定性测定

将使用WPI以及WPI-TA纳米颗粒新鲜制备的Pickering乳液中分别加入一定量的NaCl，使乳液中NaCl浓度为0、50 mmol/L以及100 mmol/L，静置40 min后通过光学显微镜观察其乳滴形态的变化。

1.4 数据统计及图表绘制方法

2 结果与分析

2.1 WPI与TA的复合比例对WPI-TA纳米颗粒形成的影响

表1 不同质量比下WPI-TA纳米颗粒的粒径与Zeta电位分析Table 1Particle size and potential of WPI-TA nanoparticles at different mixing ratios

如表1所示，当WPI与TA质量比为1∶0即没有复合TA的WPI纳米颗粒的平均粒径为101.6 nm，聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）为0.45，分布较为均匀，这与Liu Gang等[15]的研究结果一致。TA的引入使得蛋白颗粒发生聚集，即粒径有所增大，随着TA复合比例的增大，即WPI与TA的复合比例为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1时粒径分别增大至155.6、180.7、220.1 nm以及265.3 nnm，这可能是因为TA浓度的增加使得WPI的结构更加松散，从而增强了TA与WPI之间的相互作用，形成了粒径更大的聚集体[18]。然而，当TA与WPI的复合比例达到1∶1时，粒径反而减小至253.4 nm，这可能归因于TA的复合程度达到最大时，TA对蛋白的聚集程度起到抑制作用。同时，TA的引入使得蛋白溶液的PDI降低，表明由蛋白-多酚相互作用而稳定的乳液具有更加良好的分散性。纳米颗粒均为带负电，即相邻纳米粒子之间存在静电排斥作用。随着WPI与TA复合比例的增加，WPI-TA纳米颗粒的Zeta电位呈现先增大后减小的趋势，直至复合比例为2∶1时，电位达到最大值即38.9 mV，表明此时蛋白颗粒表面净电荷最多，溶液液滴之间拥有更大的静电斥力，使得溶液更加稳定得以抵抗聚集[19]。综上所述，当WPI与TA的复合比例为2∶1时，WPI-TA纳米颗粒稳定且分散均匀，因此，后续实验选择2∶1的复合比例用于Pickering乳液的制备稳定性研究。

2.2 傅里叶变换红外光谱分析

蛋白质与酚类化合物的相互作用受参与的蛋白质与酚类化合物类型的影响，可能是多种分子相互作用的结果，如疏水与静电相互作用、范德华力和氢键等[20]。多酚的结构和分子质量是影响蛋白-多酚相互作用的重要因素，具有相对较大分子质量的TA与蛋白之间的亲和力更强[21]。为了更加深入了解与分析TA与WPI之间的相互作用，利用傅里叶变换红外光谱仪对WPI-TA之间的结合类型进行鉴定。

图1 TA、WPI和WPI-TA纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱Fig.1 FTIR spectra of TA, WPI, and WPI-TA nanoparticles

如图1所示，WPI的红外光谱表现出的主要峰值为3 300 cm-1（酰胺A带，代表N—H伸缩和氢键），1 649 cm-1（酰胺I带，代表C—O伸缩/氢键和COO—）和1 533 cm-1（酰胺II带，代表C—N伸缩和N—H弯曲模式）[22]。与WPI相比，WPI-TA在酰胺A带附近的吸收峰发生了位移，复合物在3 300 cm-1的峰值蓝移了6～7 nm，说明蛋白质的—NH2参与了反应。在1 649 cm-1和1 533 cm-1处，WPI-TA的特征吸收峰强度明显增强，表明WPI与TA之间的相互作用引起C—O伸缩/氢键以及C—N伸缩振动更加剧烈。另外，TA在3 402 cm-1和1 736 cm-1处出现2 个特征峰，可能来自于酚羟基的O—H键伸缩振动，它们在WPI-TA复合物中没有出现，表明TA中的酚羟基与蛋白质肽键的羰基之间形成氢键而发生相互作用[23]。因此，WPI与TA的相互作用引起了蛋白二级结构的变化，类似地，Wang Xiaoya等[24]研究表明α-La和表没食子儿茶素没食子酸酯之间的共价相互作用导致了α-La二级结构的改变。

2.3 扫描电镜分析

图2 WPI与WPI-TA纳米颗粒的扫描电镜图Fig.2 SEM images of WPI and WPI-TA nanoparticles

由图2可知，WPI与WPI-TA纳米颗粒的表面结构存在明显差异。由图2A、C可知，蛋白具有典型的球状结构，而由图2B、D可知，球状结构消失而呈现片状，并且可以观察到TA小分子在片状结构上的附着与聚集。这可能是因为当WPI与TA发生共价相互作用时，蛋白质肽链展开并发生折叠，同时多酚通过转换成醌类物质后与蛋白分子的亲核基团发生相互作用，从而改变了蛋白所呈现的表面结构[22]。

2.4 Pickering乳液的表征

表2 不同纳米颗粒稳定的稻米油Pickering乳液的粒径、电位与乳相体积分数比较Table 2 Comparative average droplet diameter, potential and emulsified phase volume fraction of rice bran oil Pickering emulsions stabilized by WPI and WPI-TA nanoparticles

选用50%的稻米油作为油相，pH 7.0，5 mg/mL的WPI与WPI-TA 2 种蛋白溶液分别作为水相制备Pickering乳液。如表2所示，WPI稻米油Pickering乳液的粒径为77.7 μm，分散度为1.41，而由WPI-TA纳米颗粒稳定的Pickering乳液粒径减小了27.2 μm，分散度也减小至0.83。表明后者稳定的乳液拥有更小的粒径，同时体系分布更加均匀，这可能是因为WPI-TA复合物在Pickering乳液的油水界面提供了更强的相互作用，从而对乳液的聚集与合并起到了很好地抑制作用，这与Liu Gang等[15]的研究结果保持一致。

另外，从两者的Zeta电位结果分析可以得出，WPITA稳定的稻米油Pickering乳液的Zeta电位绝对值明显高于WPI稻米油Pickering乳液，为乳液液滴之间提供了更强的静电排斥作用，从而更好地稳定乳液结构，抑制乳液的聚结[25]。对于2 种蛋白颗粒稳定的Pickering乳液，乳液体积分数在乳液制备之后急剧下降直至3 h之后保持稳定。通过对二者稳定的乳相体积分数进行比较，可以得出TA的加入使得Pickering乳液的乳相体积分数从70%增大至85%，表明WPI-TA纳米颗粒拥有更高的乳化活性，同时乳相体积分数的增大可以归因于WPI与TA之间的相互作用增加了颗粒在液滴表面上的有效吸附并降低了液滴和连续相之间的密度差异[26]。

2.5 稻米油Pickering乳液的热稳定性分析

如图3A、B所示，WPI以及WPI-TA稻米油Pickering乳液在25 ℃以及50 ℃条件下，经过30 min的热处理，乳滴的微观形态并没有发生变化，仍然保持稳定的乳液结构。但在图3C中，WPI稻米油Pickering乳液由于在高温85 ℃恒温水浴环境中，而发生了破乳现象，其乳滴形状有了明显的变形，由圆形转变成不规则的图形，这是因为高温可能破坏了吸附在Pickering乳液油水界面的蛋白结构，乳滴在高温下运动加快从而发生碰撞，导致乳滴之间进行了融合而发生形态改变[15]。但即使在高温85 ℃环境中，由WPI-TA纳米颗粒稳定的稻米油Pickering乳液的乳滴形态在加热前后没有显著性差异。因此，TA的引入可以明显地改善WPI稻米油Pickering乳液的热稳定性，即由WPI-TA纳米颗粒稳定的Pickering有更好的乳液性能。类似地，Wei Zihao等[14]研究了乳蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯的共价相互作用，得出蛋白-表没食子儿茶素没食子酸酯共价复合物可以显著增强β-胡萝卜素乳液的热稳定性。

图3 不同温度下热处理30 min后WPI以及WPI-TA稻米油Pickering乳液的微观图（×20）Fig.3 Microscopic images of WPI and WPI-TA Pickering emulsion after heat treatment at different temperatures for 30 min (× 20)

2.6 稻米油Pickering乳液的盐离子稳定性分析

实际生产中，盐离子难免存在于以乳液为基础的食品和饮料中。有研究表明，在五味子籽油乳液中，NaCl浓度对乳液稳定性的影响较大，随着NaCl浓度的增大，乳液呈现愈发不稳定的趋势[27]。如图4所示，在不同盐离子浓度0、50 mmol/L以及100 mmol/L条件下，乳液均未发生破乳现象，并保持完整的乳液形态。因此可以推断，在适宜食品生产的盐离子浓度下，WPI以及WPITA稳定的稻米油Pickering乳液均表现出较高的离子稳定性。同时，对于WPI稻米油Pickering乳液，其乳液液滴大小随盐离子浓度的增大而逐渐增大，这是因为盐离子的静电屏蔽效应，导致乳液液滴之间的相互作用减弱，这与Liu Gang等[28]的研究结果一致。Shao Yu等[29]研究了盐离子的添加对大豆蛋白乳液稳定性的影响，结果表明盐离子存在的条件下，界面蛋白结构展开，乳液液滴之间形成二硫键，静电屏蔽作用加剧了乳液的絮凝。然而，对于WPI-TA稻米油Pickering乳液，其乳液液滴大小没有发生显著性变化，说明TA的加入可以有效地减小盐离子对于乳液体系带来的不利影响，提高了乳液对离子强度的稳定性。

图4 不同盐离子浓度下WPI以及WPI-TA稻米油Pickering乳液的微观图（×20）Fig.4 Microscopic images of WPI and WPI-TA Pickering emulsion at different salt ion concentrations (× 20)

2.7 乳液的氧化稳定性分析

2.7.1 乳液的初级氧化

图5 WPI以及WPI-TA稻米油Pickering乳液在贮存7 d内油脂氢过氧化物的生成情况Fig.5 Production of lipid hydroperoxide in WPI and WPI-TA rice bran oil Pickering emulsion during storage for 7 days

乳液油脂的氧化酸败是导致乳液制品品质量下降的重要原因。研究乳液氧化稳定性时，先将乳液进行加速氧化处理，将制备好的新鲜乳液分装并避光处理，把乳液置于50 ℃的恒温培养箱中并给予充足的氧气，使其加速氧化[29]。如图5所示，WPI稻米油Pickering乳液的POV明显高于WPI-TA稻米油Pickering乳液，表明TA的加入使得乳液中油脂氢过氧化物的形成得到了很好的抑制。Staszewski等[30]使用绿茶多酚-β-乳球蛋白纳米复合物作为载体分子制备鱼油水包油型乳液，在纳米复合物存在下，乳液中油脂氢过氧化物的生成量在整个贮存期间一直保持相对较低的水平，证明多酚的存在明显改善了乳液的氧化稳定性。这与本实验结果相同。同时，观察2 种乳液POV的增长趋势，WPI稻米油Pickering乳液在贮藏第3天，POV出现了明显的增大，而对于WPI-TA稻米油Pickering乳液来说，其整个一级氧化过程均表现得较为平缓，可见，WPI-TA纳米颗粒稳定的稻米油Pickering乳液在一级氧化过程中更为稳定。

2.7.2 乳液的次级氧化

图6 WPI以及WPI-TA稻米油Pickering乳液在贮存7 d内TBARS的生成情况Fig.6 Production of TBARS in WPI and WPI-TA rice bran oil Pickering emulsion during 7 days of storage

乳液的次级氧化是指乳液初级氧化产物进一步分解为醛、酸等小分子产物的过程[31]。如图6所示，乳液二级氧化物TBARS值随着时间的延长而逐渐增大，趋势与一级氧化物大致相同。在WPI稻米油Pickering乳液和WPI-TA稻米油Pickering乳液中，第1天的TBARS值分别为0.028 μg/mL和0.019 μg/mL，WPI稻米油Pickering乳液在第3天之后陡然增大，而WPI-TA稻米油Pickering乳液增长相对缓慢，而到达第7天时，测得的TBARS值分别为0.182 μg/mL和0.112 μg/mL，后者二级氧化物的生成量始终明显小于前者。可以得出TA的加入对Pickering乳液中二级氧化物的生成起到了很好地抑制作用。因此，以WPI-TA稳定的稻米油Pickering乳液拥有更好的氧化稳定性。有研究表明，多酚无论以物理复合还是共价复合的方法与蛋白质发生结合，均能提高其乳液的氧化稳定性[32]。本研究中，Pickering乳液氧化稳定性的提高得益于TA结构上的酚羟基具有很强地提供氢原子的能力，而在油脂氧化过程中，能与油脂上的某些基团发生反应，生成不易氧化的物质，使之氧化过程减缓[33]。

3 结 论

本实验通过制备WPI-TA纳米颗粒以及对其稳定的稻米油Pickering乳液的稳定性进行研究发现，WPI与TA的相互作用导致了蛋白二级结构以及表面呈现结构的变化，当WPI与TA的复合比例达到2∶1时，WPI-TA纳米颗粒粒径为（265.3±2.6）nm，电位达到（-38.9±1.4）mV。相比WPI稳定的乳液，WPI-TA稻米油Pickering拥有良好的物理及化学稳定性，能够有效抑制乳液的絮凝、氧化和沉淀。因此，WPI-TA纳米颗粒因其潜在的优势，有望成为传统乳化剂有价值的替代品应用于食品和饮料等研究领域。