NaHCO3浸泡对反复冻融鮰鱼肌肉品质的影响

章 蔚，焦春海，熊光权，汪 兰，石 柳，李 新，丁安子，吴文锦,

（1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064；2.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068）

斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）属鲶形目、鮰科鱼类，具有食性杂、生长快、适应性广、抗病力强等优点。鮰鱼有着丰富的营养价值和特殊的风味，是最受消费者喜爱的鱼类之一。斑点叉尾鮰的冷冻鱼片是我国主要的水产品出口品种之一，因此，冷链技术对其生产应用至关重要[1]。

然而，目前的冷链技术还不够完善，在水产品的长途运输、贮藏和消费中因为温度波动会不可避免地出现反复冻融的现象，导致其品质降低[2]。这一现象引起了国内外学者的广泛关注，大量研究发现反复冻融会导致肌肉组织中水分的重新分布，使得大冰晶在细胞外形成，从而对肌肉组织造成严重的机械损伤，引起脂肪、蛋白氧化，最终造成肌肉品质的下降[3-8]。同时，有研究发现冻融循环过程中品质的劣变与其持水性下降有很大关系[2]，因此，开始有研究尝试通过提高肉制品的持水性改善反复冻融对肉制品造成的不良影响。祝凯丽[9]、郭锐等[10]研究发现添加海藻酸钠、磷酸盐等保水剂对肉制品进行处理可以明显改善肉制品的持水能力，保持肌肉的品质。另外有一部分研究认为pH值与其肌肉的持水性有很大的相关性[11]，通过添加NaHCO3对肉制品进行处理，发现添加NaHCO3可以提高产品的保水性，使其在冻藏过程中较高保留汁液[12-13]。因此，通过添加NaHCO3改善反复冻融过程中肉制品的品质有一定的可行性，但目前关于NaHCO3处理对淡水鱼在冻融循环过程中的品质变化及其作用机制的研究仍鲜见报道。

本实验通过测定经不同质量浓度NaHCO3浸泡后的鮰鱼在多次冻融循环中的各项指标，研究NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼肌肉品质的影响，旨在为水产品的保鲜技术发展提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鮰鱼购于湖北省武汉市武商量贩农科院店，平均质量约为1.8～2.0 kg，鱼体鱼鳍无破损，鱼鳃鲜红，鱼眼饱满黑白分明无浑浊。

盐酸、氯化钠、硫酸钾、无水乙醇、硼酸、硫酸、三氯乙酸、盐酸胍、氯化钾、氢氧化钠、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、尿素、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙醚、氢氧化钾、二氯甲烷、甲醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、冰醋酸、牛血清蛋白（生化试剂）、考马斯亮蓝 美国Bio-Rad公司；三(羟甲基)氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）美国Sigma公司；2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二硝基苯腙（dinitrophenylhydrazone，DNPH） 瑞士Fluka公司。

1.2 仪器与设备

818 pH计 美国奥立龙公司；BS-210电子天平 德国Sartorius Instruments有限公司；CR-400色差计 日本Minolta Camera公司；DGX-9143B电热恒温鼓风干燥箱上海雷磁仪器生产厂；GL-25MS高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-2550分光光度计 日本岛津公司；TGL20M台式低速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；PHS-3BW酸度计 上海般特仪器有限公司；T18高速分散均质机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将新鲜鮰鱼在4 ℃条件下以敲头方式击杀，立即去除内脏、鱼皮，用无菌生理盐水冲洗干净。取背部鱼肉，切成4 cm×4 cm×2 cm，质量约20 g的鱼块。将鮰鱼块样品分别置于质量浓度为0、0.5、1.0 g/100 mL的NaHCO3溶液中浸泡30 min，然后用滤纸快速将表面水分擦干，封装于自封袋（4 cm×12 cm）。

处理后的样品，在-35 ℃冷冻12 h后置于-18 ℃贮藏24 h。将贮藏后的样品于4 ℃解冻12 h，记为冻融循环处理1 次的样品。将标记后的样品进行冻融循环处理，分别为1、2、4、7 次，新鲜样品记为冻融循环0 次。

1.3.2 pH值的测定

使用便携式pH计，将其探头插入鮰鱼鱼肉中测定pH值。

1.3.3 解冻损失率的测定

称取处理后的样品的初始质量（m0），称取解冻后用滤纸吸去表面水分的鱼肉质量（m1），按照式（1）计算：

1.3.4 酸价的测定

参考GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》中酸价滴定的方法进行测定[14]。计算公式如下：

式中：V为所用氢氧化钾标准溶液的体积/mL；c为所用氢氧化钾标准溶液浓度/（mol/L）；56.1为氢氧化钾的摩尔质量/（g/mol）；m为试样的质量/g。

1.3.5 TBA值的测定

参考何翠[15]的方法加以修改。取10 g绞碎鱼肉样品于凯氏蒸馏瓶中，加入20 mL蒸馏水、2 mL盐酸溶液（HCl-H2O质量比1∶2）、2 mL液体石蜡混合均匀，进行水蒸气蒸馏。取5 mL蒸馏液与5 mL 0.02 mol/L TBA溶液充分混合，100 ℃水浴加热35 min后冷却10 min，在535 nm波长处测吸光度A。计算如式（3）所示：

1.3.6 肌原纤维蛋白的提取和浓度测定

肌原纤维蛋白提取参考Yin Tao等[16]的方法；蛋白质浓度采用双缩脲测定，牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.3.7 总巯基与活性巯基的测定

参考贾丹[17]的方法加以修改。总巯基测定取1 mL质量分数0.4%的蛋白样品溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，含0.6 mol/L KCl和0.01 mol/L EDTA），室温下放置30 min。活性巯基测定取取1 mL 0.4%蛋白样品溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl，室温下放置30 min。然后取4 mL上溶液，加入0.4 mL 0.1% DTNB（pH 8.0，0.2 mol/L Tris-HCl）混合均匀后于40 ℃水浴25 min，412 nm波长处测定吸光度。计算如式（4）所示：

式中：C0为蛋白质质量浓度/（mg/mL）；A为412 nm波长处的吸光度；D为稀释倍数；ε为摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm）。

1.3.8 羰基的测定

参照贾丹[17]的方法加以修改。取0.5 mL蛋白样品溶液，加入2 mL DNPH溶液（10 mmol/L，用2 mol/L HCl溶解），另一管加入2 mL 2 mol/L HCl溶液作为对照，室温下避光静置1 h（每10 min涡旋）。随后加入2.5 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白，11 000×g离心3 min，弃掉上清液后，用2 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1∶1，V/V）洗涤3 次，弃去上清液。加入6 mL 6 mol/L的盐酸胍溶解沉淀，室温放置10 min后11 000×g离心3 min，取上清液，在370 nm波长处测定吸光度。计算如式（5）所示：

式中：C0为蛋白质质量浓度/（mg/mL）；A为370 nm波长处的吸光度；D为稀释倍数；ε为摩尔消光系数22 000 L/（mol·cm）。

1.3.9 色度的测定

将待测鮰鱼样品鱼肉切成1 cm×1 cm×1 cm的块状，用色度测定仪测定样品的色度。白度按下式计算：

式中：L*为样品的亮度；＋a*为样品偏红，-a*为偏绿；＋b*为样品偏黄，-b*为样品偏蓝。

1.4 数据处理

实验样品分别从3 条鱼体上取平行，重复测定3 次。数据使用Excel进行处理，采用SPSS 20.0进行差异显著性分析，用GraphPad Prism 5.0和Excel进行作图，用Origin 8.0进行线性方程拟合。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼pH值的影响

图1 NaHCO3质量浓度对反复冻融中鮰鱼pH值的影响Fig.1 Effects of different concentrations of NaHCO3 on pH value with different freeze-thaw cycles

如图1所示，未经NaHCO3浸泡的鮰鱼肉pH值在前4 次冻融循环过程中无显著差异，但在第7次冻融循环后从初始的6.87显著下降至6.67；经0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉pH值经过4 次冻融循环后从初始的7.65显著下降至6.81，然后基本保持稳定；经1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉pH值经过7 次冻融循环后从初始的8.04显著下降至6.92。随着冻融次数的不断增加，鱼肉的pH值显著下降。已有研究表明，鱼肉pH值在反复冻融过程中受诸多因素影响，鱼体受糖酵解作用会发生乳酸的积累[18]；鱼体内的蛋白质和脂肪在反复冻融过程中变性降解产生游离氨基酸和游离脂肪酸；蛋白质分子间、蛋白分子与水分子间的结合能力受离子化和表面电荷的影响而改变，从而影响pH值的变化[19]。在冻融过程中，经过NaHCO3浸泡后的鮰鱼pH值均显著高于未经NaHCO3浸泡组，且NaHCO3质量浓度越高，处理后的鱼肉pH值越高。这是因为NaHCO3溶液呈碱性，它对冻融过程中鱼肉pH值的降低有一定的缓冲作用。另外，研究发现，当冻融后期的pH值下降至肌肉蛋白等电点时，肌肉的持水性大大降低，从而导致水分的流失。当水分流失趋于饱和时，pH值的变化不再显著[20]，这可能也是本实验中冻融后期pH值变化趋于平缓的原因。

2.2 NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼解冻损失率的影响

如图2所示，鮰鱼的解冻损失率在冻融循环前期显著上升，在冻融循环中期基本保持稳定，然后在冻融循环后期显著上升。经7 次冻融循环后，未经NaHCO3浸泡、经0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、经1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼的解冻损失率分别显著上升了12.89%、6.75%、6.48%。Jiang Qingqing[21]、Rahman[22]等研究发现肌肉的解冻损失率随冻融循环的增大而增大，并发现解冻损失率与肌肉组织的微观结构以及冰晶状态有很大关系。鮰鱼在反复冻融过程中蛋白变性使肌肉的微观结构发生变化，从而导致持水性下降，水分慢慢流失直至饱和。随着冻融循环次数的不断提高，鮰鱼会不断地经历冰晶的溶解-再形成过程，其肌肉细胞膜和细胞器在冰晶的机械力作用下不断损伤并最终破裂，导致汁液的大量流失[23]。经NaHCO3浸泡后的鮰鱼解冻损失率相较于未经NaHCO3浸泡的有了一定的降低，且经NaHCO3浸泡后的鮰鱼解冻损失率在反复冻融过程中的上升速率明显低于未经NaHCO3浸泡组，但不同质量浓度NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉间解冻损失率无显著差异，说明NaHCO3浸泡能一定程度地维持鱼肉在反复冻融过程中的持水性。

图2 NaHCO3质量浓度对反复冻融中鮰鱼解冻损失率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of NaHCO3 on thawing loss with different freeze-thaw cycles

2.3 NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼脂肪氧化特性的影响

图3 NaHCO3质量浓度对反复冻融中鮰鱼脂肪氧化特性的影响Fig.3 Effects of different concentrations of NaHCO3 on fatty oxidation with different freeze-thaw cycles

酸价和TBA值分别是判断脂肪氧化的重要指标，酸价和TBA值越高，说明样品的脂类腐败越严重[24]。如图3所示，不同质量浓度的NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉在反复冻融过程中酸价和TBA值均呈线性增长，对其进行数据拟合，得到不同质量浓度NaHCO3浸泡后脂肪氧化特性与冻融次数的线性方程见表1，各方程的拟合度均较高（R2＞0.9）。如图3所示，经4 次冻融循环后，未经NaHCO3浸泡的鱼肉TBA值达到15 μg/g，此时鱼肉开始有明显的劣变气味，品质出现恶化，基本不能食用。另外，经过7 次冻融循环后，未经NaHCO3浸泡、经0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、经1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼酸价分别显著上升了25.2%、20.8%、23.3%，TBA值分别显著上升了67%、64.8%、70.5%。反复冻融过程会使部分抗脂肪氧化的酶类失活；同时，反复冻融使鱼肉类的冰晶分布发生变化，损坏了肌细胞的完整性，促使一些促氧化成分释放[21,25-26]。另外，反复冻融过程中形成的冰晶会在样品表面形成细微孔洞，脂肪与空气的接触面积增大，从而导致脂肪更易氧化酸败[3]。常海军[4]、陈丽丽[27]等通过研究发现，肉制品的TBA值随冻融次数的增加而增大，说明反复冻融会加剧脂肪氧化程度。但经NaHCO3浸泡后，鮰鱼肉酸价和TBA值均显著降低。如表1所示，当未发生反复冻融时，经NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉酸价和TBA值相较于未经NaHCO3浸泡组明显降低。同时，在反复冻融过程中，经NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉酸价和TBA值增长速率均低于未经NaHCO3浸泡组，说明NaHCO3浸泡能有效延缓鱼肉在反复冻融过程中的脂肪氧化，且用1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡较0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡效果更好。

表1 不同质量浓度NaHCO3浸泡下鮰鱼在反复冻融中脂肪氧化的线性方程与相关系数Table 1 Linear equation and correlation coefficients for fatty oxidation at different concentrations of NaHCO3 as a function of the number of repeated freeze-thaw cycles

2.4 NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼蛋白特性的影响

蛋白质的溶解度与肌肉品质紧密相关，一般情况下，肌肉品质会随着蛋白质溶解度的降低而下降[26]。如图4所示，在前4 次冻融循环后鮰鱼的蛋白质溶解度显著下降，然后基本保持稳定。未经NaHCO3浸泡、经0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、经1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼的蛋白质溶解度在7 次冻融循环后分别从初始的84.87、114.18、146.66 mg/g显著下降至33.19、41.88、51.18 mg/g。Leygonie等[28]、李婉竹[29]通过研究发现蛋白溶解度随冻融次数的增加而显著下降。蛋白质在反复冻融过程空间结构发生变化，产生了二硫键、疏水键等，使得蛋白间的作用力加强、与水之间的结合力减弱[30]；另外，蛋白在反复冻融过程中氧化变性，从而发生聚合[27]，这些都会导致蛋白溶解度的下降。经过NaHCO3浸泡后，鮰鱼的蛋白溶解度要显著高于未经NaHCO3浸泡组，且在一定范围内，NaHCO3质量浓度越高，蛋白质溶解度越高。Petracci等[31]认为，NaHCO3可以增强蛋白间的静电排斥力提高其溶解度，从而降低剪切力。

图4 NaHCO3质量浓度对反复冻融中鮰鱼蛋白溶解度的影响Fig.4 Effects of different concentrations of NaHCO3 on protein solubility with different freeze-thaw cycles

图5 NaHCO3质量浓度对反复冻融中鮰鱼蛋白氧化特性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of NaHCO3 on protein oxidation with different freeze-thaw cycles

一般认为，巯基含量越低，羰基含量越高，蛋白变性程度越高[32]。如图5所示，不同质量浓度的NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉在反复冻融过程中总巯基、活性巯基均呈线性下降，羰基含量呈线性增长，对其进行数据拟合，得到不同质量浓度NaHCO3浸泡后蛋白氧化特性与冻融次数的线性方程见表2，各方程的拟合度均较高（R2＞0.9）。如图5所示，经7 次冻融循环后，未经NaHCO3浸泡、经0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡、经1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡后的鮰鱼总巯基含量分别显著下降至0.089、0.09、0.10 mg/g；活性巯基含量分别显著下降至0.040、0.050、0.063 mmol/g；羰基含量分别显著上升至5.92、5.48、4.97 mmol/g，说明鮰鱼在反复冻融过程中蛋白氧化程度加深。随着冻融次数的增加，蛋白质氧化程度加深，活性氧自由基大量产生，使得蛋白质中的氨基酸发生脱氨反应向羰基转化，羰基含量显著提高。同时，冻融循环中蛋白质的空间结构发生变化，导致巯基向二硫键转化，巯基含量显著降低[32]。如表2所示，当未发生反复冻融时，经NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉总巯基和活性巯基含量相较于未经NaHCO3浸泡组显著提高，羰基含量显著下降。但在反复冻融过程中，经NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉总巯基含量较未经NaHCO3浸泡组下降速率加快，不同质量浓度的NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉活性巯基含量下降速率差异不大，而经NaHCO3浸泡后的鮰鱼肉羰基含量上升速率明显减慢。说明在反复冻融过程中，NaHCO3浸泡能提高蛋白质的溶解度和一定程度地延缓鱼肉的蛋白氧化，且用1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡较0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡效果更好，但NaHCO3浸泡不能有效阻止甚至会加剧细胞的破坏，从而导致更多的二硫键暴露，使得巯基下降速率加快。

表2 不同质量浓度NaHCO3浸泡下鮰鱼在反复冻融中蛋白氧化的线性方程与相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients for protein oxidation at different concentrations of NaHCO3 as a function of the number of repeated freeze-thaw cycles

2.5 NaHCO3浸泡对反复冻融中鮰鱼白度的影响

图6 NaHCO3质量浓度对冻融循环过程中白度的影响Fig.6 Effects of different concentrations of NaHCO3 on whiteness with different freeze-thaw cycles

如图6所示，未经NaHCO3浸泡后的鱼肉白度经4 次冻融循环后从初始的52.75显著下降至50.44，然后在第7次冻融循环后显著回升至53.06，经0.5、1.0 g/100 mL NaHCO3浸泡的鱼肉白度经7 次冻融循环后分别从初始的54.53、56.89显著下降至51.85、52.33。同时，经过NaHCO3浸泡的鮰鱼肉白度值在前4 次冻融循环过程中显著高于未经NaHCO3浸泡组，且NaHCO3质量浓度越高，处理后的鱼肉白度值越高，但当冻融循环次数增加到7时，不同处理组间的差异显著性消失。Jiang Qingqing等[21]通过研究发现，金枪鱼在反复冻融后鱼肉光泽逐渐消失，变得暗淡，并认为这是因为脂质氧化以及蛋白变性对光散射产生影响所致。在本实验中，NaHCO3浸泡可以延缓脂肪氧化和蛋白变性，维持鱼肉的持水性，因此可以一定程度的保持鱼肉的色泽，但仍随着冻融次数的增加而显著下降。另外，未经NaHCO3浸泡的鱼肉在后期冻融循环过程中白度值显著增加，这可能是因为反复冻融使得冰晶状态不断发生变化，肌肉受机械破坏严重，大量水分渗出附着在鱼肉表面，使光反射增加[33]，从而导致白度值的提高。

3 结 论

经过NaHCO3浸泡后，鱼肉pH值、蛋白溶解度、总巯基含量、活性巯基含量、白度上升；解冻损失率、酸价、TBA值、羰基含量下降。随着冻融次数的增加，鱼肉的pH值、蛋白溶解度、总巯基含量、活性巯基含量、白度显著下降；解冻损失率、酸价、TBA、羰基含量显著上升，表明反复冻融导致鱼肉的品质下降、脂肪氧化程度、蛋白变性程度增加。但在反复冻融过程中，NaHCO3浸泡后的鮰鱼脂肪氧化速率和蛋白氧化速率要低于未经NaHCO3浸泡组，表明NaHCO3浸泡可以一定程度地抑制鱼肉的脂肪氧化和蛋白氧化，保持鱼肉的持水能力，从而有效地保持肌肉的品质，且1.0 g/100 mL较0.5 g/100 mL NaHCO3浸泡组效果更好。因此可以通过NaHCO3浸泡保持鮰鱼在加工保鲜过程中鱼肉的肌肉品质。