开菲尔粒中乳酸菌的筛选与发酵特性

孙 敏，孙 玥，李 博，梅 俊*

（1.上海城建职业学院健康与社会关怀学院，上海 201415；2.上海城建职业学院城市食品安全研究所，上海 201415；3.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；4.光明乳业股份有限公司，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436；5.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

开菲尔粒起源于高加索地区，在其蛋白质、多糖构成的骨架上栖息着乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多种有益微生物，在牛乳或羊乳中培养时，能同时进行乳酸、醋酸和乙醇发酵，制得一种黏稠且含醇、酸及少量CO2，称之为开菲尔（Kefir）的发酵乳[1-2]。开菲尔在高加索地区、中东以及我国青藏高原地区较为流行[3-4]。地区间由于气候和环境的差异导致开菲尔粒的微生物多样性有所差别，掌握开菲尔粒的微生物多样性差异和变化情况有利于掌握其发酵过程、产物及代谢机理等[5-6]。开菲尔粒中的乳酸菌是近些年来的研究热点，从中分离到的乳酸菌主要有开菲尔乳杆菌（Lactobacillus ke firi）、开菲尔基质乳杆菌（Lb. kefiranofaciens）、Lb. kefirgranum、类高加索酸奶乳杆菌（Lb. parakefir）、短乳杆菌（Lb. brevis）、干酪乳杆菌（Lb. casei）、副干酪乳杆菌（Lb. paracasei）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、乳脂链球菌（S.cremoris）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等[7-9]。

开菲尔粒中的乳酸菌能够产生乳酸和抗菌肽，抑制腐败和病原微生物的生长，为生产健康、安全的酸乳提供条件。本研究通过对开菲尔粒中的乳酸菌进行分离，筛选具有抑菌活性的乳酸菌株，研究其发酵特性，评价所分离到的菌株作为酸乳发酵剂的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

开菲尔粒 西藏那曲某农贸市场；大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923 昀冠（上海）生物科技有限公司；原料乳 光明乳业股份有限公司；培养基 杭州微生物试剂有限公司；过氧化氢酶上海阿拉丁生化试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，由上海阿拉丁生化试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

FD-1冷冻干燥机 上海田枫实业有限公司；Neofuge 13R台式高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；LRH-250F恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；TA-TX2质构仪 英国Stable Micro System公司；R/S plus旋转流变仪 美国Brook field公司；pH计瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离和筛选

取开菲尔粒约1 g，加入9 mL生理盐水，混匀后，进行梯度稀释，分别取不同稀释梯度溶液100 µL涂布于MARS培养基，37 ℃培养18 h，取单个菌落在MARS培养基上划线纯化。筛选到的乳酸菌菌株在37 ℃条件下发酵脱脂乳48 h后，离心（8 000 r/min、20 min、4 ℃），得到可能富含抑菌多肽的上清液，冻干后制成5 g/100 mL溶液，冷藏备用。

制备大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液（约7 （lg（CFU/mL））），分别取100 µL大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液涂布于各自培养基上，静置30 min后，取5 µL上述上清液冻干粉溶液加于其上，37 ℃培养12 h，观察是否有明显抑菌圈。筛选出上清液能明显抑制大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923生长的乳酸菌菌株。

1.3.2 产抗菌肽乳酸菌的复筛

有机酸的排除[10]：将上清液冻干粉溶液的pH值调至6.0，用磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作为对照组，对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923进行抑菌实验。

过氧化氢的排除[11]：将上清液冻干粉溶液的pH值调至7.0，加入10 mg/mL过氧化氢酶，37 ℃水浴2 h，pH值调至6.0，以pH 6.0、未加过氧化氢酶处理的上清液冻干粉溶液作为对照，对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923进行抑菌实验。

1.3.3 抗菌肽抑菌效果测定

将上清液冻干粉分别配成质量浓度为200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.560、0.780、0.390、0.195 mg/mL的溶液。50 mL培养杯中加入18.8 mL营养肉汤培养液、1 mL不同质量浓度的冻干粉溶液和0.2 mL大肠杆菌ATCC25922或金黄色葡萄球菌ATCC25923菌液，测定630 nm波长处光密度（optical density，OD630nm）后37 ℃培养12 h，再次测定OD630nm。OD630nm增加值反映细菌的增长量。

1.3.4 菌株抗热能力测定

取0.2 mL筛选到的乳酸菌菌液，加入10 mL MARS液体培养基中，混匀后测定OD630nm。将菌液分别在40、50、60、80、100 ℃条件下水浴加热10 min，取不同温度处理的菌液与10 mL MARS液体培养基混合均匀后于37 ℃条件下培养12 h，再次测定OD630nm。OD630nm增加值反映细菌的增长量。

1.3.5 16S rDNA法鉴定菌株

将分离的菌株委托上海桑尼生物科技有限公司进行16S rDNA鉴定。

1.3.6 酸乳的制备

根据杨爽等[12]方法，用本研究分离得到的菌株制备酸乳发酵剂，然后分别按照2、3、4 g/100 mL添加量加入到杀菌原料乳中，搅拌均匀后在42 ℃条件下发酵6 h，发酵完成后在室温下保持30 min，转移到4 ℃冰箱中后熟24 h，此时记为0 d。继续在4 ℃冰箱中贮藏，在贮藏0、5、10、15、20、25、30 d时取样检测。

1.3.7 酸乳pH值测定

采用余萍等[13]的方法，取25.0 mL酸乳，高速离心均质（5 000 r/min，1 min），混匀后，用pH计测定。

1.3.8 酸乳滴定酸度测定

采用Sert等[14]的方法，取5 g酸乳样品，置于三角瓶中，加入20 mL去离子水，滴2 滴酚酞溶液，摇匀后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色，并且在30 s内不褪色，记录消耗0.1 mol/L氢氧化钠的体积。滴定酸度（吉尔涅尔度）按式（1）计算。

式中：V为滴定时消耗的0.1 mol/L氢氧化钠体积/mL；F为0.1 mol/L氢氧化钠的校正系数；20为酸乳的稀释倍数。

1.3.9 酸乳硬度测定

按照Saleh等[15]的方法，采用质构仪进行测定。采用柱形探头，其平端直径25 mm；测试前探头下降速率10 mm/s，测试速率1 mm/s，测试后探头回程速率5 mm/s；测试距离10 mm；触发力5 g。由质构特性曲线图得出的最大压缩力表示酸乳样品的硬度（N）。

1.3.10 酸乳黏度测定

按照Wang等[16]的方法，采用旋转流变仪，cc-25转子，转子和圆筒空隙2.00 mm。在4 ℃条件下，以300 s内剪切速率（γ）0～512 s-1获取黏度曲线，读取γ=100 s-1时的黏度（Pa·s）。

1.3.11 酸乳持水率测定

按照Feng Cuijiao等[17]的方法，准确称取15.0 g酸乳，置于离心管中，4 ℃条件下3 600 r/min离心15 min后倒掉上清液，测定残余物的质量。持水率按式（2）计算。

式中：m1为收集到的残余物质量/g；m2为酸乳样品质量/g。

1.3.12 酸乳脱水收缩率测定

按照袁祎琳等[18]的方法，将20.0 g未经搅拌的酸乳样品放置于Whatman No.1滤纸中，4 ℃条件下过滤2 h，用烧杯收集过滤出的乳清。脱水收缩率按式（3）计算。

式中：m1为收集到的乳清质量/g；m2为酸乳样品质量/g。

1.3.13 酸乳感官评价

由15 名感官品评人员组成的评定小组对冷藏保存15 d的酸乳样品进行感官评定，对酸乳样品的组织、色泽、气味和口感进行描述性评价，采用百分制评分法，参照Kim等[19]的方法制定评价标准（表1）。

表1 酸乳感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of yogurt

1.4 数据处理

实验结果以平均值±标准差表示，用SPSS 19.0软件对结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌性乳酸菌的筛选

筛选出1 株能明显抑制大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923生长的乳酸菌株，其离心分离得到的上清液也能明显抑制大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的生长。排除了有机酸和过氧化氢抑菌的影响（未列出结果），判定抑菌物质为上清液中的抗菌肽。

由图1可知，当所筛选乳酸菌发酵上清液冻干粉质量浓度大于6.250 mg/mL时，抑制大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923生长的效果明显。由文献[20-22]可知，抗菌肽的最低抑制质量浓度为1～100 μg/mL。所筛选乳酸菌株发酵上清液冻干粉对测试菌株的最低抑制质量浓度与文献相比较高，其原因可能是除了抗菌肽以外，还含有一定量的乳酸菌代谢产物，如乳酸、乙酸等有机酸，以及培养基中的部分可溶性成分等。

2.2 乳酸菌株的抗热能力

由图2可知，加热温度40 ℃时测得菌液OD630nm为0.23。当加热温度升高时，微生物存活率降低，其OD630nm也降低，当加热温度达到60 ℃以上时OD630nm＜0.05，表明多数菌株已经死亡，因此分离得到的乳酸菌对温度较为敏感，推断该乳酸菌株为嗜温菌。

2.3 菌株的鉴定结果

将测序得到的序列在NCBI数据库中比对，得到该菌株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。干酪乳杆菌可以促进人体消化吸收、调节肠道菌群平衡、提高人体免疫力、抗癌和降血压等，还可以赋予乳制品特殊的风味[23-24]。干酪乳杆菌具有优良的保健功能并且能够在人体胃肠道内比较稳定地存活，被普遍应用于功能性食品领域，特别是发酵乳制品生产中，干酪乳杆菌常用于发酵酸乳和干酪制作或与其他乳酸菌种配合使用发酵酸乳。

2.4 酸乳pH值与滴定酸度

由图3可知，所制得酸乳的pH值在冷藏0 d时为4.57～5.15，发酵剂添加量越大其pH值越低，同时，冷藏期间各样品pH值呈下降趋势，但在冷藏期内pH值变化无明显差异。

由图4可知，酸乳冷藏期间滴定酸度变化与pH值基本对应，发酵剂添加量越大，滴定酸度越大，随着冷藏时间的延长，滴定酸度也增加。

2.5 酸乳硬度与黏度

对于消费者来讲，酸乳硬度是一个非常重要的指标。由图5可知，发酵剂添加量越大，酸乳会产生更为致密的酪蛋白凝胶结构，酸乳硬度明显增加。酸乳发酵越充分，酪蛋白凝胶结构彼此间或与水分间可以连接在一起，形成对酪蛋白凝胶结构的重排，因此，所形成的结构越稳固，硬度越大。

消费者在食用酸乳之前一般先要进行搅拌，为了模拟典型的消费者食用方式，酸乳测定前需要进行搅拌，并不会引起黏度损失[25]。由图6可知，所制得酸乳的表观黏度随着发酵剂添加量的增加而增加，同时冷藏时间延长，其表观黏度减小。

酸乳硬度和黏度的改变是由于酪蛋白形成的三维网状结构的变化，三维网状结构越紧密，酸乳的硬度和黏度就越大。本研究中，发酵剂添加量越大，所制得酸乳的硬度和黏度越大，可能是由于酸乳pH值低，形成了更紧密的酪蛋白三维网状结构。在冷藏过程中，所有样品的硬度和黏度呈略微下降趋势，可能是由于蛋白三维网状结构被破坏[26-27]。

2.6 酸乳持水率与脱水收缩率

脱水收缩性是对酸乳质量进行评价的重要指标之一，牛乳中的蛋白质形成凝胶时的收缩导致乳清分离，这对酸乳的质量不利[28]。由图7可知，发酵剂添加量增大可以明显降低脱水收缩率，冷藏0 d时，发酵剂添加量4 g/100 mL酸乳的脱水收缩率为22.03%，而发酵剂添加量2 g/100 mL和3 g/100 mL酸乳的脱水收缩率均高于25%。在冷藏过程中，酸乳脱水收缩率均先下降后逐渐上升。

由图8可知，冷藏0 d时，发酵剂添加量2 g/100 mL酸乳的持水率为62.60%，明显低于其他酸乳样品。所制得酸乳冷藏期间的持水率先上升后下降，其变化趋势与脱水收缩率基本对应。酸乳持水率与凝胶酪蛋白的持水能力有关，一般来讲，持水率越高，酸乳凝乳的稳定性就越高。发酵剂添加量越高，所制得酸乳具有更高的持水率，外观表现为乳清析出量越少。脱水收缩性和持水性的产生是由于酪蛋白凝胶网络结构的弱化导致酪蛋白持水能力下降，使得与酪蛋白结合的水分析出。发酵剂中的乳酸菌可以改变pH值，使得酪蛋白胶束通过等电沉淀进行聚合，在酸乳冷藏过程中，酪蛋白胶束被打断，聚合度下降[29]。

2.7 酸乳感官评价结果

表2 不同添加量干酪乳杆菌发酵剂酸乳的感官评价结果Table 2 Sensory evaluation results of yoghurt with different inoculums amounts of Lactobacillus casei

由表2可知，发酵剂添加量2、3、4 g/100 mL酸乳的感官评价总分分别为70.04、80.03和81.13，得分的差距主要体现在组织和口感方面。由于发酵剂添加量高，产生更多的乳酸，使得酪蛋白胶束通过等电点沉淀进行聚合，形成致密的酪蛋白凝胶网络结构，因此具有更顺滑的质构。在气味方面，发酵剂添加量越多，滋气味越好，更多的乳酸菌在发酵过程中可以更好地利用脂肪酸和氨基酸产生酯类、醇类、酸类等化合物，并在咀嚼时释放[30]。发酵剂添加量对酸乳色泽影响较小，无明显差异。总体来说，使用干酪乳杆菌发酵剂的酸乳经过15 d冷藏后整体表现与商业酸乳仍存在差距，感官品评者在备注中表示口感不够细腻柔和。

3 结 论

利用培养基分离开菲尔粒中的乳酸菌菌株，然后以大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923为抑菌对象进行抑菌实验，筛选具有抑菌效果的菌株。分离发酵上清液制备冻干粉，在排除有机酸和过氧化氢的影响后，初步判定抑菌物质为上清液中的抗菌肽。未纯化的抗菌肽质量浓度大于6.250 mg/mL时，抑制大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923生长的效果明显，利用16S rDNA方法，初步鉴定该菌株为干酪乳杆菌。以干酪乳杆菌作为发酵剂，分别以发酵剂添加量2、3、4 g/100 mL发酵全脂乳，42 ℃发酵6 h再后熟24 h后，4 ℃冷藏0、5、10、15、20、25、30 d时分别测定理化指标和进行感官评定，结果表明，发酵剂添加量越大，所制得酸乳的pH值、滴定酸度、硬度、黏度、持水率和脱水收缩性等指标明显更优，优于发酵剂添加量2 g/100 mL酸乳。但是在多数指标上，发酵剂添加量3 g/100 mL和4 g/100 mL 2 组酸乳指标无明显差异，从成本出发，后续实验宜使用干酪乳杆菌发酵剂添加量3 g/100 mL发酵酸乳。