基于核磁共振氢谱的超高温灭菌乳和复原乳中脂肪酸含量差异分析

苏美丞，贾 曼，张 霞，谭冬飞，张清阳，尹增浩，王少雷，陈 刚*

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

营养价值是评价食品品质的指标之一，营养物质的含量、种类、特性则是评价食品营养价值的重要依据。牛乳产品因其丰富的营养价值受到人们的喜爱，同时也被列入许多国家的膳食推荐指南，在我国国家卫生和计划生育委员会2016年发布的《中国居民膳食指南》中，推荐成人每日乳制品摄入量为300 g。芬兰、澳大利亚、瑞士、加拿大等国家推荐的每日乳制品摄入量为500～750 mL[1]。牛乳中含有人体所需的六大营养成分（碳水化合物、脂肪、蛋白质、矿物质、维生素和水），其中，三大产能营养成分（碳水化合物、脂肪、蛋白质）在牛乳中的含量为10%～12%，仅次于水（含量约为87%）。

脂肪酸是脂肪的主要组成成分，由C、H、O 3 种元素构成，按照饱和度可将脂肪酸分为3 类：饱和脂肪酸（碳链不含双键）、单不饱和脂肪酸（碳链只含有1 个双键）和多不饱和脂肪酸（碳链含有2 个及2 个以上双键）；而根据碳链上双键出现的位置，又将这些不饱和脂肪酸分为n-3、n-6系等不饱和脂肪酸[2]。脂肪酸与许多疾病的发生有着密切关联，如饱和长链脂肪酸会增加低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平，进而增加患动脉粥样硬化和心血管疾病的风险[3]。不饱和脂肪酸可以降低Ⅱ型糖尿病人的血糖水平[4]，降低高胆固醇患者中血清总胆固醇含量；经常摄入富含单不饱和脂肪酸的食物可以调节血脂、保护心脏、降低动脉损伤的风险[5]。多不饱和脂肪酸还具有改善内分泌、抗血栓、延缓大脑和皮肤衰老、促进生长发育的作用[6-9]。

牛乳中含有约400 种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸在乳脂中占比较低，乳中脂肪酸的组成受饲料、哺乳期、季节、奶牛品种的影响[10-12]。加工工艺也可能导致牛乳产品中脂肪酸发生改变。崔婧[13]利用高分辨质谱对复原乳和超高温灭菌乳的脂质组成进行研究，发现15 种脂质在超高温灭菌乳和复原乳中具有显著差异（P＜0.001），其中包含大部分中长链饱和脂肪酸和少量短链脂肪酸及单不饱和脂肪酸，这些变化极有可能与温度相关。魏小豹等[14]对食用油中的脂肪酸进行研究，也证实脂肪酸含量和种类的变化与加热温度有关，主要表现为饱和脂肪酸含量增加，不饱和脂肪酸含量减少，以及中、短链和环状脂肪酸种类增加。

脂肪酸是一种热敏性物质，受外界环境（光照、温度、奶牛饲养条件等）的影响，脂肪酸在食品中的分布和含量会有所变化，牛乳加工过程中，预热、灭菌、喷雾干燥等过程均会对牛乳有不同程度的加热，会导致牛乳中不饱和脂肪酸等发生氧化、降解[28]。目前，生鲜乳、巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳脂肪酸含量的差异检测分析研究较多，而超高温灭菌乳和复原乳中的研究较少。脂肪酸对维持生命机能、保持身体健康具有重要作用[29]，因此，对超高温灭菌乳和复原乳中的脂肪酸进行研究能够为不同加工工艺牛乳中的脂肪酸含量和分布提供数据支持，同时能为牛乳脂肪酸的品质评价及牛乳产品的营养评价提供参考，尤其是对高胆固醇患者等有特殊需求的人群有重要意义。

本研究利用1H NMR技术，对超高温灭菌乳和复原乳中的脂肪酸进行研究，阐明2 种产品中脂肪酸的含量和种类，为牛乳的脂肪酸品质评价提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择北京各大超市售卖的超高温灭菌乳和全脂乳粉，为保证实验具有代表性，选择10 种品牌不同批次生产的样品，每种样品各收集10 份。样品在分析前均在4 ℃、避光条件下保存。

氘代氯仿（CDCl3，氘代率99.8%，含体积分数0.03%四甲基硅烷） 美国Cambridge Isotope Laboratories公司；甲醇（色谱纯）、氯仿（色谱纯）美国Thermo Fisher Scienti fic公司。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；BS 223S精密电子天平 华东医药有限公司；Advance Ⅲ 400 MHz核磁共振仪 德国Bruker公司；HN 200多功能氮吹仪济南海能仪器股份有限公司；Biofuge Stratos离心机美国Thermo Fisher Scienti fic公司；Vortex Genius 3涡旋混合仪 德国IKA公司；ST500核磁管 美国Norell公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

参考李强强等[25]建立的乳品脂质1H NMR检测技术，以蛋白质含量3 g/100 mL为标准，准确称量一定质量乳粉溶于2 mL超纯水中，涡旋10 min，使乳粉充分混匀，获得复原乳，备用。

将1 mL超高温灭菌乳（或复原乳）样品、6 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶剂加入至15 mL玻璃离心管中；涡旋2 min，混匀后加入2 mL超纯水，再涡旋2 min，混匀后放入离心机，4 ℃、2 000 r/min条件下离心20 min；将下层有机相转移至另一玻璃离心管中，氮吹至透明薄膜状；加入1 mL氘代氯仿，涡旋复溶，转移600 μL至核磁管中待测。

此时谢逊刚刚击杀了海沙派、巨鲸帮等几个惯常偷鸡摸狗的帮会的老大，口称他们品行不端，予以惩戒。这对于正直的张翠山来说，自是“行侠仗义”之所为。然而接下来谢逊却又要对剩下的在场所有人下手，看来颇为不符大侠风范，于是张翠山跳出来喝止了这一行为，并有了上述的对话。

1.3.2 数据采集与分析

使用400 MHz Bruker核磁共振仪进行1H NMR数据采集，实验温度298 K，脉冲序列为zg 30；采样次数16 次，数据点数64 000，谱宽8 233.70 Hz，采样时间3.98 s，弛豫时间4 s，调谐增益50.80。

使用Topspin 3.60软件对获得的图谱进行处理，手动调节相位并校正基线，将内标物四甲基硅烷化学位移（δ）设置为0，用阿拉伯数字对各个峰进行标注并积分，对峰面积进行归一化处理。

将获得的积分数据导入Excel软件，分别计算2 组数据（复原乳和超高温灭菌乳）的组内相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），剔除组内差异大的积分数据（RSD＜20%），并对处理后的积分数据进行定量。

将各峰面积和脂肪酸含量导入SIMCA 14和SPSS 25软件中进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和独立样本t检验。

1.3.3 结果计算

用A1～A8、A9a、A9b和A10～A12表示1H NMR图谱中各个峰的面积，根据1H NMR图谱中峰面积与该峰的质子数成正比，分别按公式（1）～（5）计算超高温灭菌乳和复原乳中亚麻酸、亚油酸、油酸、不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的相对含量。

2 结果与分析

2.1 1H NMR图谱分析

以超高温灭菌乳为例，样品中提取的脂肪酸1H NMR图谱如图1所示。1H NMR图谱上的信号峰代表牛乳中脂肪酸不同质子的官能团信息，图谱中主要存在12 组信号峰，从高场到低场方向分别用数字1～12进行标注。以李强强[25]、李玮[30-31]等对不同乳制品及食用油中脂质的研究为参考，将2 种牛乳中的各个信号峰进行脂肪酸质子的官能团归属分析（表1）。

表1 牛乳脂1H NMR图谱中信号峰归属[25,30-31]Table 1 Assignment of signal peaks in 1H NMR spectra of milk lipids[25,30-31]

由图1及表1可知：1号峰（δ0.85～0.91）和2号峰（δ0.92～0.98）分别代表饱和脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中末端甲基质子和亚麻酸中的末端甲基质子，二者共代表了牛乳中所有脂肪酸链的末端甲基质子信号；3号峰（δ1.22～1.36）代表所有脂肪酸链上的亚甲基质子；4号峰（δ1.55～1.65）和5号峰（δ1.65～1.70，三重峰）代表所有脂肪酸链上与羰基（-OCO-或COOH-）相隔1 个亚甲基基团的亚甲基质子；6号峰（δ1.92～2.11）代表脂肪酸链上与碳碳双键（-C＝C-）相连的β位上的亚甲基质子；7号峰（δ2.25～2.36）代表脂肪酸链上与羰基相邻的亚甲基质子；8号峰（δ2.36～2.42）代表脂肪酸链上与羰基相邻的2 个亚甲基质子；9号峰（δ2.74～2.84）代表亚麻酸和亚油酸中位于2 个碳碳双键间的亚甲基质子，其中δ2.78～2.84处的三重峰代表亚麻酸，δ2.74～2.78处的二重峰代表亚油酸；10号峰（δ4.10～4.34）和11号峰（δ5.23～5.31）分别代表脂肪酸甘油基团上的亚甲基质子和次甲基质子；12号峰（δ5.31～5.40）代表所有不饱和脂肪酸中碳碳双键上的质子。

表2 超高温灭菌乳和复原乳中脂肪酸相对含量Table 2 Relative contents of fatty acids in UHT milk and reconstituted milk%

由表2可知，超高温灭菌乳和复原乳中不饱和脂肪酸相对含量最高，分别为（56.59±1.89）%、（56.19±2.34）%，亚麻酸相对含量最低，分别为（0.98±0.11）%、（0.90±0.04）%，亚油酸相对含量分别为（1.15±0.36）%、（1.11±0.36）%，油酸相对含量分别为（27.30±0.56）%、（26.78±0.78）%，饱和脂肪酸相对含量分别为（43.26±1.56）%、（43.81±2.34）%。2 种乳中各类脂肪酸的相对含量相近。

2.2 OPLS-DA和独立样本t检验

对峰面积进行OPLS-DA能够获得2 种乳的分类图（图2），从OPLS-DA结果可知，超高温灭菌乳与复原乳能够被区分开。根据变量投影重要性（variable importance in the project，VIP）分析，提取出对2 种乳分类具有重要影响（VIP＞1，VIP由软件自动计算）的变量，其中，对2 种乳分类影响较大的变量为A9、A11、A1、A7、A3、A4、A6。A1代表饱和脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，A3、A4和A7代表所有脂肪酸，A6代表所有不饱和脂肪酸，A9代表亚麻酸和亚油酸，A11代表甘油基团。

研究表明，中短链脂肪酸受温度影响比长链脂肪酸明显，多不饱和脂肪酸受温度影响比饱和、单不饱和及双不饱和脂肪酸明显[14]。结合超高温灭菌乳和乳粉的加工工艺分析，温度可能是引起2 种乳中脂肪酸出现差异的主要原因。对于乳粉喷雾干燥过程，喷雾干燥进风口温度为120～130 ℃，与超高温灭菌温度相近，脂肪酸的变化可能主要发生在此阶段。受到第2次高温加热，牛乳中的脂肪酸组分和含量发生变化，导致复原乳中饱和脂肪酸相对含量比超高温灭菌乳中略高，不饱和脂肪酸、亚麻酸、油酸和亚油酸相对含量比超高温灭菌乳中略低，且亚麻酸相对含量具有显著差异。在喷雾干燥过程中，不饱和脂肪酸可能发生氧化，生成饱和脂肪酸，也可能是长链脂肪酸降解形成新的中短链饱和脂肪酸。

2.3 营养学评价

根据超高温灭菌乳和复原乳中脂肪酸的差异，对2 种乳进行初步营养学评价。总体来说，超高温灭菌乳和复原乳中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸相对含量相近，表明二者营养价值相近。超高温灭菌乳中亚麻酸相对含量显著高于复原乳，对高血脂、高胆固醇等人群有益；亚麻酸和亚油酸在体内能够代谢为花生四烯酸和二十二碳六烯酸，对提高记忆力、儿童大脑发育、肥胖人群有益。中短链脂肪酸水溶性大于长链脂肪酸，能够从小肠被迅速吸收到门静脉循环中，研究表明，饮食中摄入短链和中链脂肪酸对高血脂和患有营养不良吸收综合征（如囊性纤维化）的患者有益[32-33]，复原乳中的中短链脂肪酸相对含量增加，可能对这些人群比较有益。

3 结 论

对超高温灭菌乳和复原乳中的脂肪酸含量差异进行研究，结果表明：超高温灭菌乳和复原乳中各类脂肪酸相对含量相近，亚麻酸在2 种乳中相对含量最低，且超高温灭菌乳中的相对含量显著高于复原乳。此外，简单分析了温度对2 种乳中脂肪酸含量差异的影响，并对2 种牛乳进行了初步营养学评价，为牛乳中脂肪酸的营养评价和研究提供了基础数据。