超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛乳中19 种β-受体激动剂残留

关学农，张 敏，苏运聪，王 瑶,*，李 飞，李兴佳，杜利卫，张耀广，柴艳兵

（1.河北省食品工业协会，河北 石家庄 050021；2.君乐宝乳业集团，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，河北 石家庄 050021）

激动剂也称兴奋剂，是一种能增强分子活性、促进某种反应的药物、酶激动剂和激素类分子[1]。由于能激活或增强中枢神经系统活性，兴奋剂会对人的生理、心理产生极大危害，包括心力衰竭、激动狂躁、前列腺肥大、糖尿病、心脏病等，严重损害身心健康[2]。β-兴奋剂类药物俗称“瘦肉精”，常用的包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十几种物质，其中以克伦特罗和沙丁胺醇最为常见。

克伦特罗（又名双氯醇胺、氨哮素、克喘素），是一种人工合成的β-受体激动剂，可以松弛支气管平滑肌。克仑特罗为瘦肉精的主要成分，由于能促进蛋白质合成，提高动物的瘦肉率而备受关注[3]。但克伦特罗在动物可食性组织中残留蓄积，导致食用这些动物组织的人产生中毒反应，进一步危害人体健康。沙丁胺醇与克伦特罗的促生长作用相差不大，将其作为饲料添加剂使用，也可以显著促进动物生长、提高饲料转化率和瘦肉率，而且在动物体内的消除时间更短，毒性较弱，因此沙丁胺醇成为克伦特罗最理想的替代品[4]。但在养殖过程中沙丁胺醇被长期、超量使用，也会在动物组织中残留蓄积，仍然对人们食用动物组织的安全性存在极大威胁。

农业部235号公告中《动物性食品中兽药最高残留限量》将克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗列为所有食品动物可食组织的禁用药物。但2020年1月实施的农业农村部第250号公告《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中把β-兴奋剂类及其盐、酯列为食品动物中禁止使用的药品，因此有必要加强对兴奋剂类物质的监控。

目前检测β-激动剂类兽药残留的方法主要包括液相色谱法[5-8]、液相色谱-质谱法[9-13]、气相色谱法[14]、气相色谱-质谱法[15-18]和酶联免疫分析法[19-20]等。酶联免疫分析法易出现假阳性，液相色谱与气相色谱法检测灵敏度较低，目前液相色谱-质谱法应用更广泛，因此本研究建立采用超高效液相色谱-串联质谱法测定牛乳中β-受体激动剂含量的方法，以期为牛乳中兴奋剂类物质的监测和管控提供科研依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳 市售。

克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特布他林、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、喷布特罗、齐帕特罗、西布特罗、溴布特罗、克仑潘特、羟甲基克仑特罗、苯氧丙酚胺、克仑普罗、班布特罗、利托君、马贲特罗标准品（纯度均大于95%）德国Dr.Eherenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）、甲酸（质谱级） 德国默克公司；甲酸铵（色谱级） 美国Sigma公司；实验用水为超纯水（18.0 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪、Oasis PRIME H L B柱（5 0 0 m g，6 m L）、B E H C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；Milli-Q ZMQS50001超纯水机 美国密理博公司；LYNX4000高速落地离心机 美国Thermo公司；ME203E/02电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

19 种β-受体激动剂兽药化合物标准储备溶液（100 μg/mL）：分别称取适量克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特布他林、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、喷布特罗、齐帕特罗、西布特罗、溴布特罗、克仑潘特、羟甲基克仑特罗、苯氧丙酚胺、克仑普罗、班布特罗、利托君、马贲特罗标准品，用甲醇溶解，分别配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备溶液，-20 ℃条件下保存。

19 种β-受体激动剂兽药化合物混合标准中间液（100 ng/mL）：分别移取适量19 种兽药化合物标准储备溶液（100 μg/mL），用甲醇定容，配制成质量浓度为100 ng/mL的混合标准中间液，-20 ℃条件下保存。

19 种基质混合标准系列工作液：准确移取混合标准中间液（100 ng/mL）适量，用空白基质溶液配制成质量浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的基质混合标准系列工作液，现配现用。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 前处理方法优化

考察3 种不同前处理方法对加标牛乳样品中目标化合物回收率的影响。

样品提取液的制备：取经混匀的生牛乳1.00 g于50 mL离心管中，加入5 mL萃取试剂（100 mL乙腈和0.2 mL甲酸混合均匀，现配现用），涡旋振荡1 min，10 000 r/min条件下离心5 min，得上清液。

方法1：样品提取液直接上机检测。取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后上机检测。

方法2：样品提取液经固相萃取柱净化后上机检测。取Oasis PRIME HLB固相萃取柱，用体积分数80%乙腈水溶液活化后，将上清液过柱，保持1 滴/s的流速，收集全部流出液，经0.22 μm有机滤膜过滤后上机检测。

方法3：样品提取液经固相萃取柱净化后经氮吹浓缩复溶后上机检测。用体积分数80%乙腈水溶液活化Oasis PRIME HLB固相萃取柱后，将上清液过柱，保持1 滴/s的流速，收集全部流出液，氮气吹干，加入1 mL体积分数50%甲醇水溶液溶解，经0.22 μm有机滤膜过滤后上机检测。

1.3.2.2 提取溶剂优化

最常用的提取溶剂为甲醇和乙腈，因此选择甲醇、乙腈为提取溶剂对样品进行处理，比较2 种提取溶剂对19 种β-受体激动剂类药物提取效率的影响。

1.3.3 色谱条件

BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，进样量5 μL，流速0.3 mL/min，流动相采用甲醇与5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱。洗脱梯度见表1。

表1 超高效液相色谱流动相梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase gradient conditions for UPLC

1.3.4 质谱条件

检测模式：多反应监测模式；离子源控制条件：毛细管电压2.00 kV；锥孔反吹气流速150 L/h；脱溶剂气温度450 ℃；脱溶剂气流速900 L/h；离子选择参数参见表2。

表2 19 种β-受体激动剂离子选择参数Table 2 Selected ion parameters for 19β-agonists

续表2

1.4 数据处理

使用Origin 9绘图软件进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的确定

2.1.1 前处理方法的选择

考察3 种不同前处理方法对加标牛乳样品中目标化合物回收率的影响。由图1可知，采用方法1时，19 种目标化合物的回收率均明显低于60%，可能是由于牛乳中的杂质，如脂肪、蛋白质等[21]对样品检测产生干扰，因此需要进一步净化以去除杂质对检测的影响。采用方法2上机检测发现，19 种目标化合物的回收率均有所提高，均大于60%，其中有8 种目标化合物的回收率为70%～100%，说明该方法能够有效去除杂质干扰。但由于该方法的样品体积较大，检测浓度低，导致检测精密度较差，因此有必要对样品进行浓缩后再上机检测。采用方法3上机检测发现，19 种目标化合物的回收率均可达到70%～100%。此外与方法2相比，各物质的回收率有了进一步提高，样品的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均在10%以内，提高了检测的准确度。因此最终确定采用HLB固相萃取柱净化后浓缩复溶的样品制备方法。

2.1.2 提取溶剂的选择

由图2可知，以甲醇和乙腈为提取溶剂，19 种目标化合物加标回收率无明显差异，均能够达到70%～100%。但由图3～4可知，以甲醇为提取溶剂时色谱峰较杂乱，说明甲醇提取的样品中杂质较多；乙腈有较好的沉淀蛋白作用，因此综合考虑，选取乙腈作为提取溶剂。

2.2 标准曲线、回收率和精密度

采用超高效液相色谱-串联质谱检测时常出现基质干扰现象，本研究采用基质曲线进行分析。

将配制好的19 种基质混合标准系列工作液上机检测，以目标峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，建立标准曲线方程。对分别添加0.2、0.5、1.0 μg/kg 19 种目标化合物的牛乳样品进行处理，每个添加量6 份平行试样，按最优方法提取、净化和测定，计算加标回收率，考察方法准确度。计算RSD，考察方法精密度。

表3 19 种β-受体激动剂的标准曲线方程、相关系数、回收率和精密度Table 3 Calibration equations, correlation coef ficients, recovery rates and precision for 19β-agonists

由表4可知，在0～10.0 ng/mL范围内，19 种β-受体激动剂的线性方程均满足R2≥0.995的要求。牛乳中19 种β-受体激动剂的回收率为70.6%～104.5%，准确度较高。RSD为1.1%～11.7%，精密度较高。

2.3 方法检出限及定量限

向空白样品中添加适量的19 种β-受体激动剂混合标准溶液，经最优方法测定，得到特征离子质量色谱峰信噪比（RS/N）和对应的各物质质量浓度，RS/N=3时对应的质量浓度为方法检出限，RS/N=10对应的质量浓度为方法定量限。当取样量为1.0 g，定容体积为1 mL时，计算出本方法的检出限为0.01 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg。

3 结 论

通过考察2 种常见的提取溶剂和不同提取方法对牛乳中19 种β-受体激动剂提取效率的影响，最终确定以乙腈为提取溶剂，Oasis PRIME HLB固相萃取柱净化后采用外标法进行定量。该方法操作简单快捷、灵敏度好、精密度高，可满足牛乳中19 种β-受体激动剂同时检测的要求，同时也可以为其他类兽药残留检测提供技术支持。