孤独症谱系障碍患儿肠道菌群与症状严重程度相关性分析

曾 津 危松青 王曼知

孤独症谱系障碍(ASD)包括典型孤独症、不典型孤独症、阿斯伯格综合征等[1]。该病症多发生于儿童期，男童发病率显著高于女童，患儿普遍存在不同程度的智力发育障碍、癫痫、离别性焦虑障碍等共患病[2]。现有研究[3]指出，父母生育年龄大、孕期接触杀虫剂、困难抚养型气质等为ASD的独立风险因素。近些年来有关肠道菌群在ASD发生、发展中的作用的研究与日俱增[4]。国外研究[5]指出，微生态-肠-脑轴在ASD发生、发展之中扮演着重要的角色。但是，国内外种族因素、生活习惯因素、饮食因素之间存在着明显的差异性，所以已有研究是否适用于我国ASD患儿尚不可知。故本研究选取长沙市中心医院90例ASD患儿为研究对象，对ASD患儿肠道菌群结构特点及与症状严重程度的相关性展开分析，报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 在获得医学伦理委员会批准后选取长沙市中心医院2016年1月～2019年10月收治的90例ASD患儿为ASD组，纳入标准：(1)经孤独症诊断观察量表(ADOS-2)[6]确诊为ASD者；(2)年龄≤14岁者；(3)同意此次研究方案并签署知情同意书。排除标准：(1)采样前3个月服用过抗生素药物、微生态制剂者；(2)以往有头部外伤史、脑器质性疾病史、神经系统疾病史者。ASD组患儿90例，其中男70例，女20例；年龄2～5岁，平均(3.5±1.2)岁；病程3个月～2.5年，平均(1.1±0.2)年；症状严重程度：轻度20例，中度40例，重度30例；分娩方式：自然分娩79例，剖宫产11例；喂养方式：母乳喂养55例，混合喂养25例，人工喂养10例。另选同期50名体检健康的儿童为对照组，其中男39名，女11名；年龄2.0～4.5岁，平均(3.0±1.5)岁；分娩方式：自然分娩40名，剖宫产10名；喂养方式：母乳喂养31名、混合喂养14名、人工喂养5名。两组受试者性别、年龄、分娩方式、喂养方式等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2 方法

1.2.1 症状严重程度评定 应用孤独症治疗评估表(Autism Treatment Evaluation Checklist，ATEC)[7]对ASD患儿进行评定，该量表由表达/语言沟通、社交能力、感知/认知能力、健康/生理/行为4个维度构成，总分0～179分。症状严重程度：20～49分为轻度、50～79分为中度、>80分为重度。

1.2.2 肠道菌群测定 采集两组新鲜粪便250 mg后利用美国Omega公司生产的Soil DNA Kit试剂盒进行肠道菌群DNA提取工作。利用美国赛默飞世尔科技公司生产的ABI 2720PCR基因扩增仪对16srRNAV3～V4可变区进行PCR扩增，上游引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。利用美国Illumina公司生产的MiSeqTMDx基因测序仪进行测序。形成的原始测序序列利用Trimmomatic质控软件进行质控，利用Macromedia Flash软件进行拼接处理。采用UPARSE软件计算相对丰度，根据97%的相似度对原始测序序列进行操作分类单元聚类处理，利用UCHIME软件对嵌合序列进行鉴定以及剔除操作。采用RDP分类器算法对处理后的测序序列实施物种分类注释，与SSU123数据库进行对比，设置比对阈值70%。利用线性判别分析对差异丰富的分类群进行LEfSe，区分最有生物学特征的肠道菌群。

1.2.3 观察指标 取ATEC评分，巨单胞菌属(Megamonas)、巨球型菌属(Megasphaera)、肠道巴恩斯氏菌(Barnesiella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas)、真杆菌属(Eubacterium rectale group)、埃希氏菌属(Ezakiella)、链球菌属(Streptococcus)、梭杆菌属(Fusicatenibacter)相对丰度为观察指标。

2 结果

2.1 两组ATEC评分、菌群相对丰度比较 ASD组ATEC评分为(60.5±5.5)分，对照组ATEC评分为(12.0±2.0)分，ASD组高于对照组(t=52.413，P=0.000)。在门水平比较上，ASD组厚壁菌门、酸杆菌门肠道菌群相对丰度低于对照组(P<0.05)。在科水平比较上，ASD组瘤胃球菌科、链球菌系链球菌科、消化链球菌科与Erysipelotrichacese肠道菌群相对丰度低于对照组(P<0.05)，韦荣球菌科、肠杆菌科肠道菌群相对丰度高于对照组(P<0.05)。见表1，表2。ASD组巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌、霍尔德曼氏菌、肠球菌、酸杆菌、拉乌尔菌、阿里松氏菌LEfSe分析结果高于对照组(P<0.05)，真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属、真细菌、短真杆菌、Intestinibacter、Candidatus-Soleaferrea、Romboutsia、未知属f型瘤胃菌、Adlercreutzia、unclassified-f-Coriobacteriaceae、Ruminiclostridium-6、eubacterium-ventriosum-group、Ruminococcaceae-UCG-013、霍氏真杆菌、Lachnospiraceae-NC2004-group、厌氧棍状菌属低于对照组(P<0.05)。见图1。

图1 两组受试儿童不同肠道菌群LEfSe分析结果

表1 两组儿童门水平肠道菌群相对丰度比较

表2 两组受试儿童科水平肠道菌群相对丰度比较

2.2 ASD组内不同症状严重程度患儿菌群相对丰度比较 ASD组内不同症状严重程度患儿巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌、真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。近一步两两比较发现，轻度ASD患儿巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌菌群相对丰度低于中度和重度ASD患儿(P<0.05),真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度高于中度和重度ASD患儿(P<0.05)。中度ASD患儿巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌菌群相对丰度低于重度ASD患儿(P<0.05),真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度高于重度ASD患儿(P<0.05)。见表3。

表3 ASD组内不同症状严重程度患儿菌群相对丰度比较

2.3 ASD组肠道菌群与症状严重程度相关性 Spearman相关分析结果提示，巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌相对丰度与ASD症状严重程度呈正相关(P<0.05)，真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度与ASD症状严重程度呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 ASD组肠道菌群与症状严重程度相关性

3 讨论

ASD属于一种脑发育性障碍，以社会交往障碍、沟通交流障碍、重复局限的兴趣行为为主要症状表现[8，9]。绝大多数患儿于3岁前起病，随着年龄的增加以及对儿童社会性要求的提高，症状表现越发明显[10，11]。该病症对儿童身心健康以及社会发展造成的影响十分巨大，但时至今日ASD的病因以及发病机制依然尚未明确，更缺乏行之有效的药物治疗方案，患儿往往需要长期教育训练以及行为干预，症状表现才能够得到有效缓解[12]。然而，国外最新研究提示，微生态-肠-脑轴交互作用为ASD的重要发病机制[13]。赵英欣等[14]研究亦证实了这一点。赵锐豪等[15]在其研究中证实，与健康对照组相比，孤独症谱系障碍组α多样性指数、粪便厚壁菌门(Firmicutes)比例降低，酸杆菌门(Acidobacteria)比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)，巨单胞菌属为ASD患儿的优势菌群，与其健康/身体/行为和语言评分之间呈现出正相关性(P<0.05)。由此结果表明，ASD患儿的病情发展、症状严重程度与肠道菌群之间存在着密切的关联性。本次研究中ASD组ATEC评分较对照组更高，表明其病情更为严重。在门水平比较上，ASD组厚壁菌门、酸杆菌门肠道菌群相对丰度低于对照组(P<0.05)。在科水平比较上，ASD组瘤胃球菌科、链球菌系链球菌科、消化链球菌科与Erysipelotrichacese肠道菌群相对丰度低于对照组(P<0.05)，韦荣球菌科、肠杆菌科肠道菌群相对丰度高于对照组(P<0.05)。由此结果提示ASD组部分门水平、科水平肠道菌群存在着异常改变情形。进一步对比结果提示：巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌、真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属等具有代表性的肠道菌群相对丰度在ASD组与对照组之间比较差异存在统计学意义(P<0.05)，表明肠道菌群在ASD发生中占有重要地位，所得结果与已有研究成果基本相吻合。进一步研究证实，巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌相对丰度随着ASD患儿症状严重程度的提高而升高(P<0.05)，真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度随着严重程度的提高而降低(P<0.05)，据此推测肠道菌群与ASD患儿症状严重程度之间存在着密切的关联性。Spearman相关分析结果提示，巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌相对丰度与ASD症状严重程度呈正相关(P<0.05)，真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度与ASD症状严重程度呈负相关(P<0.05)，验证了以上猜测。结合以上研究成果，本研究指出，ASD患儿存在着明显的肠道菌群紊乱情形，门水平以及科水平均匀性失衡，即巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌相对丰度升高，真杆菌属、埃希氏菌属、链球菌属、梭杆菌属相对丰度下降，使得短链脂肪酸-丁酸含量异常，后者为厌氧发酵重要的代谢产物，全程参与到了肠黏膜通透性、血脑屏障功能以及大脑功能的调节进程之中，并且丁酸还可以激活TWIK相关酸敏感钾离子通道，削弱肠上皮黏膜屏障功能，加剧脑组织中发生的氧化应激反应，使线粒体功能受损，额叶皮质处于异常兴奋状态，兴奋基因过表达下引起相应的行为症状表现。

综上所述，巨单胞菌属、巨球型菌属、肠道巴恩斯氏菌、铜绿假单胞菌在ASD患儿肠道菌群中占比处于较高水平且与症状严重程度呈正相关。肠道菌群紊乱与ASD的发生、发展密切相关，纠正肠道菌群紊乱有助于ASD患儿获得更大收益。