转录因子21与KiSS- 1转移抑制基因在结直肠癌中的表达及相关性分析

陈昌江，杨春康，吴贤毅，庄咏，官申，简锦亮

福建省肿瘤医院/福建医科大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤外科，福州350014

结直肠癌已成为中国发病率上升最快的恶性肿瘤之一[1]，严重威胁着国人的生命与健康。肿瘤的复发和转移是当前影响治疗效果的主要难题，更是影响患者预后的关键因素。KiSS-1转移抑制基因（KiSS-1 metastasis suppressor，KISS1）作为肿瘤转移抑制基因，已被研究证实其表达下调与结直肠癌等多种肿瘤的远处转移密切相关[2]。转录因子 21（transcription factor 21，TCF21）属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix proteins，BHLH）家族成员，是一类具有转录调节作用的效应因子，能介导间质细胞向上皮细胞的转化，其表达下调可能促进肿瘤细胞的扩散[3-6]。本研究旨在通过检测TCF21与KISS1在结直肠癌组织中的表达情况，分析二者是否存在相关性及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年7月至2018年10月福建省肿瘤医院收治的结直肠癌患者的病历资料。所有患者均有明确的病理学诊断，术前均未行放化疗等辅助治疗，临床及病理资料完整。共纳入71例结直肠癌患者，其中男47例，女24例；年龄27～80岁，平均（61.51±11.33）岁；临床分期：I+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期34例；有淋巴转移31例，无淋巴转移40例；有远处器官转移12例，无远处器官转移59例。收集结直肠癌根治术后原发肿瘤组织及相应癌旁正常组织各71例。

1.2 试剂

浓缩型鼠抗KISS1单克隆抗体（sc101246）购自美国Santa Cruz公司；浓缩型兔抗人TCF21蛋白多克隆抗体（ab32981）购自英国Abcam生物公司；二抗试剂盒PV9001及二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）-kit试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学通用二步法

将组织2.5 μm连续切片后60℃恒温箱烘烤过夜，以使切片紧密黏附；顺序经二甲苯，梯度酒精脱蜡、水化；TCF21和KISS1均采用柠檬酸缓冲液高压热力修复；加3% H2O2溶液孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗，TCF21孵育1 h，KISS1孵育2 h；依序滴加PV9001工作液试剂1、2，各自孵育20 min；滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色，显微镜下控制显色，时间3～10 min；苏木素复染，自来水返蓝，脱水透明后中性树胶封片，室温20～30℃。

1.4 染色结果判定

KISS1以已知阳性切片为阳性对照，TCF21以正常肺泡上皮细胞切片为阳性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗，其他步骤不变。采用双盲阅片，随机观察5个高倍镜视野（×400）范围，结果采用半定量方法判断。染色程度评分：无显色为0分，浅黄色或黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占比例评分：＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项评分相乘，0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。阳性表达率=（弱阳性+中等阳性+强阳性）例数/总例数×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，相关性分析采用Spearman等级法检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCF21、KISS 1表达情况的比较

TCF21表达于肿瘤细胞核或细胞质中，以细胞质表达明显；结直肠癌组织中TCF21的阳性表达率为66.20%（47/71），明显低于癌旁正常组织的91.55%（65/71），差异有统计学意义（χ2=21.434，P＜0.01）。KISS1表达于肿瘤细胞质中；结直肠癌组织中KISS1的阳性表达率为70.42%（50/71），明显低于癌旁正常组织的94.37%（67/71），差异有统计学意义（χ2=14.030，P＜0.01）。（图1）

图1 TCF21、KISS 1在结直肠癌组织中的表达情况（免疫组织化学染色，×200）

2.2 不同临床特征的结直肠癌患者的结直肠癌组织中TCF21、KISS 1表达情况的比较

不同性别、年龄、分化程度、病理类型、浸润深度、瘤体大小以及有无脉管癌栓、坏死、神经浸润的结直肠癌患者的结直肠癌组织中TCF21与KISS1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。有淋巴结转移、有远处转移及临床分期为Ⅲ+Ⅳ期的结直肠癌患者的结直肠癌组织中TCF21阳性表达率分别低于无淋巴结转移、无远处转移及临床分期为I+Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（χ2=5.230、8.849、7.649，P＜0.05）；有淋巴结转移、有远处转移及临床分期为Ⅲ+Ⅳ期的结直肠癌患者的结直肠癌组织中KISS1阳性表达率分别低于无淋巴结转移、无远处转移及临床分期为I+Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（χ2=4.034、7.515、6.622，P＜0.05）。（表1）

2.3 TCF21与KISS 1表达情况的相关性

TCF21与KISS1在结直肠癌、癌旁正常组织中的阳性表达率均呈正相关（r=0.450、0.365，P＜0.05）。

3 讨论

TCF21参与了肾、肺等器官的形态发生过程，介导间充质-上皮转化（mesenchymal-epithelialtransformation，MET）过 程 。 Richards等[7]认 为TCF21基因的表达缺失可能是肿瘤细胞获得侵袭特性的一种原因，并在多种恶性肿瘤中处于甲基化沉默状态或表达缺失。TCF21基因的沉默表达可能导致正常的MET过程被逆转，即出现上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT），这也正是多种恶性肿瘤侵袭与转移的重要机制[8]。本研究发现在结直肠癌组织中TCF21同样存在低表达或表达缺失，且与结直肠癌的转移特性密切相关，这是否与发生了EMT过程相关，有待更多的研究证实。

表1 不同临床特征的结直肠癌患者的结直肠癌组织中TCF21、KISS 1表达情况的比较（n=71）

目前对结直肠癌中引起KISS1基因表达下调的具体调控机制研究仍较少，日本学者在恶性黑色素瘤的研究中发现，KISS1基因表达缺失与染色体6q16.3-q23区域的杂合性缺失密切相关，而TCF21基因恰位于人染色体6q23-24[9]。Khelifa等[10]同样在黑色素瘤的研究中发现TCF21通过与另外的BHLH蛋白（E12和TCF12）结合而作用于KISS1基因的上游启动子，从而增强KISS1基因的表达水平；相反，TCF21的表达沉默将会引起KISS1基因上游启动子无法被有效激活而出现KISS1基因的表达下调甚至沉默，同时引起肿瘤细胞的侵袭与迁移活性增强。国内学者张辉等[11]发现TCF21和KISS1基因与肾癌的侵袭转移相关，TCF21在肾癌细胞中能够正性调节KISS1的表达。本研究发现结直肠癌中TCF21与KISS1的表达与临床分期、淋巴结转移及远处转移均密切相关，且二者呈正相关。故推测在结直肠癌的恶性演进过程中TCF21可能同样正性调控KISS1的表达而达到肿瘤转移抑制作用。

综上所述，TCF21与KISS1的表达与结直肠癌的病理特征密切相关，其联合检测，对预测结直肠癌复发和转移风险可能具有一定的价值。TCF21基因有可能通过调节KISS1基因表达或其他机制影响结直肠癌的复发与转移过程。