基质金属蛋白酶基因多态性与涎腺腺样囊性癌患者预后的相关性研究

王锦锋，李晓琰，任鹏飞，张晨，李斌，张媛，秦红霞#

1郑州大学第一附属医院口腔预防科，郑州450000

2郑州大学附属儿童医院（郑州儿童医院）口腔科，郑州450018

3郑州大学附属肿瘤医院分子病理科，郑州450008

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是对人体危害最大的头颈部恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的40%，其两大特性是局部的高复发率及肺、骨、肝等部位的高转移率[1]。腺样囊性癌短期预后较好，但远期生存率显著降低，尤其肺转移是主要致死病因之一。因SACC复发及转移缺乏有效的生物标志物，难以判定其预后，故寻找一种有效的标志物不仅能判定其预后，还有可能提供新的治疗方案。恶性肿瘤的浸润、转移是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程，也是恶性肿瘤患者的主要致死原因。研究表明，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一组与恶性肿瘤浸润和转移相关的重要调节蛋白。目前已发现20余种MMP，在口腔癌浸润和转移中，关于MMP的研究仍较少，其中MMP2、MMP9已有少量报道[2-3]，且多为其表达水平与肿瘤发生发展关系的研究。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因组中重要的遗传变异形式，以往已有大量研究发现致癌基因或抑癌基因SNP与肿瘤发病及预后存在密切关系[4-5]。目前，MMP2和MMP9基因遗传变异是否影响SACC患者预后的研究尚未见报道。基于此，本研究结合生物信息学预测及高通量遗传变异基因分型技术，探讨MMP2和MMP9基因SNP与SACC患者预后的相关性，以期寻找可以指导SACC患者预后的新型分子标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2009年1月至2015年1月郑州大学第一附属医院收治的92例SACC患者。纳入标准：①初治患者且均行手术治疗；②经组织病理学检查确诊为SACC，病理切片由两位独立的病理科医师重新评估；③肿瘤起源于大涎腺、小涎腺。排除标准：术前接受放疗、化疗及免疫治疗等其他治疗。92例SACC患者中，男41例，女51例；年龄21～76岁，中位年龄51岁；根据第7版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期标准进行临床分期：I期12例（13.0%），Ⅱ期22例（23.9%），Ⅲ期 26例（28.3%），Ⅳ期 32例（34.8%）；参照Szanto标准[6]将病理类型分为3级：I级37例（40.2%），Ⅱ级30例（32.6%），Ⅲ级25例（27.2%）；有神经侵犯54例（58.7%）。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 血液样本DNA提取采集每位患者约4 ml空腹静脉血到含有乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的抗凝管中。分离血浆后，血细胞用全血基因组小量抽提试剂盒（购自北京百泰克生物技术有限公司）提取DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，定量后标记置于-80℃冰箱冻存备用。

1.2.2 目标SNP选择及基因分型通过NIH SNP Function Prediction数据库（https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.html）筛选MMP基因家族代表性基因MMP2和MMP9，包含上下游2000 bp区域所有潜在影响基因表达的SNP。选择标准：①中国人群中次等位基因型频率＞0.05及候选位点连锁不平衡相关程度＜0.8；②位点位于基因外显子、5'非翻译区、启动子区及3'非翻译区。然后利用Sequenom Mass Array高通量技术平台进行基因分型检测。SNP基因型分组采用显性模型，即野生基因型vs突变基因型（杂合突变+纯合突变）。

1.3 随访

自手术日开始，定期记录患者病情变化，随访至患者死亡或随访截止日期（2018年2月），其中失访3例，失访按删失数据计算。生存时间定义为手术日期至死亡或随访截止日期。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Log-rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征的SACC患者死亡情况的比较

临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有周围神经侵犯的SACC患者死亡率分别明显高于临床分期为I～Ⅱ期、无周围神经侵犯的SACC患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；不同年龄、性别和病理分级患者的死亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的SACC患者死亡情况的比较（n=92）

2.2 MMP基因SNP在SACC中的分布

利用NIH功能性SNP预测数据库筛选了MMP2基因中3个SNP（rs243832、rs7201、rs243831）和MMP9基因中 2个 SNP（rs3918249、rs3918241）进行基因分型检测。其中4个SNP位点可能影响转录因子结合，1个SNP位点可能影响miRNA结合（表2）。对92例患者进行基因分型后，计算每个SNP位点等位基因型频率，与表2中中国人群优势等位基因型频率相比无显著差异。

表2 MMP基因SNP检测位点

根据每个SNP位点野生基因型和突变基因型将患者分组，分析不同MMP基因SNP位点患者死亡情况是否存在差异。MMP2基因rs243832野生型（GG）患者死亡率高于突变型（GC+CC）患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。其他不同SNP位点患者死亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 不同MMP基因SNP位点患者死亡情况的比较（n=92）

2.3 不同rs243832基因型患者的生存情况

rs243832位点40例GG基因型患者中位生存时间为69.1个月，短于52例GC+CC基因型患者的94.8个月，差异有统计学意义（χ2=6.544，P=0.011）。（图1）

图1 rs243832位点GG基因型（n=40）与GC+CC基因型（n=52）患者的生存曲线

3 讨论

SACC是颌面外科最常见的恶性肿瘤之一，易沿神经扩散，浸润性极强，易造成远处转移。虽然随着治疗手段的进步，患者的生存率有所提高，但转移和复发仍然是其死亡的主要原因。以往关于SACC临床预后研究常集中在致癌基因或抑癌基因在患者组织中表达水平与疾病进展的关系方面[7-8]。虽然取得了一定进展，但尚未应用于临床。由于肿瘤组织存在瘤内异质性，组织样本的取材位置不同极有可能造成不同的检测结果，因此寻找基于血液样本的新型标志物将有助于更好地评估SACC患者预后，指导临床精准治疗[9]。

MMP又称间质蛋白酶，在降解细胞外基质和基膜、促进肿瘤转移过程中发挥重要功能，同时还具有原发和继发肿瘤的生长调节效应、调节细胞黏附及促进新生血管形成等功能。目前已知的MMP至少有25种，其中MMP2和MMP9研究最为广泛，是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，在肿瘤的血管化、肿瘤侵袭及转移灶形成中发挥重要作用。已有大量研究表明MMP2和MMP9表达水平与肿瘤预后密切相关，包括肾癌[10]、胶质瘤[11]、食管癌[12]等多种常见肿瘤。而MMP与SACC的研究较少，Wang等[13]研究发现相比于正常人群，MMP2更容易在SACC患者组织中表达，提示MMP2在SACC发生及进展中发挥一定作用。另一项研究同样发现SACC患者组织中MMP2表达明显升高，并且有潜在的预测患者预后的价值[14]。本研究中发现MMP2基因rs243832不同基因型患者中位生存时间存在差异（69.1个月vs94.8个月），而生物信息学预测rs243832位点不同基因型可影响多个重要转录因子结合，从而可能影响MMP2基因表达，最终参与SACC恶性进展，然而具体分子机制仍需进一步功能验证。在另一项关于MMP2基因SNP与鼻咽癌的发病风险研究中，同样未发现MMP2基因rs7201位点与肿瘤发生及进展存在相关性[15]。而MMP9基因rs3918249位点与子宫内膜癌发病风险显著相关[16]，但在本研究中未发现其与SACC预后存在显著相关性。因此，基于更大样本量以及覆盖更多SNP位点的SACC预后研究有待进一步开展。

已有大量研究发现SNP与多种肿瘤发病及预后存在密切关系[17]。然而目前SNP与SACC的临床相关性研究仍未见报道，因此寻找并鉴定可以评估SACC患者预后的SNP位点，建立SACC预后诊断标志物，对于临床指导具有重要意义。