宏基因组测序法检测市售益生菌产品的菌种组成

曹淑曼 王雪涵 田薇

摘要：目的：通过微生物宏基因组测序方法检测10种市售益生菌产品的菌种组成。方法：从益生菌产品中直接提取微生物宏基因组DNA，采用第二代高通量基因测序方法进行宏基因组测序，对测序结果进行生物信息學分析，确定每种产品中益生菌的菌种组成以及相对丰度。结果：所检测的10种产品中，仅有2种产品的检测结果与产品说明中所标注的菌种组成完全相符，其他产品均与各自标注有不符合之处，主要表现为菌种缺失或（和）含有其他混杂菌种。两次独立抽样检测结果一致。结论：监管部门需要对益生菌产品质量进行严格监控，而微生物宏基因组测序技术为监管部门提供了一个检测益生菌产品菌种组成的新方法。

关键词：益生菌;宏基因组;菌种组成

人体健康与人体共生的各种微生物密切相关，益生菌通过四个主要机制对人体产生有益的影响[1]：通过结合在粘附位点与病原菌竞争来干扰病原菌的定殖[2];改善肠道上皮细胞的屏障功能[3];参与免疫调节[4];通过免疫系统[5]和神经递质产生对身体其他器官的影响[如γ氨基丁酸（GABA）和5羟色胺][6]。市场上常见的益生菌主要包括双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）的微生物群。例如，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 53103可促进微生物群的关键成分与宿主上皮之间的相互作用，潜在地促进了肠道定居微生物的抗炎通路[7]，从而改善肠道微环境;长双歧杆菌可促进抗肿瘤免疫并加强抗PDL1的功效[8]。益生菌的功能具有种属特异性和个体差异性，即使属于同一菌种的不同菌株，也会有功效的差异。例如，假链状双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）CECT 7765能够有益地调节慢性应激反应[9]，假链状双歧杆菌IPLA 36007有益于异黄酮活化[10]，而假链状双歧杆菌G4可以抑制血胆固醇的增加[11]。因此，益生菌菌种乃至菌株的正确使用是益生菌产品发挥功能的最重要的一环。

除了传统上用于食品生产加工的菌种外，原卫生部办公厅发布的《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》中，列出了7个菌属共计35个益生菌菌种可用于食品[1217]。市场上的益生菌产品所使用的菌株应当符合国家标准，并且应当标注明确到具体的菌株。目前鉴定益生菌的方法大多限于传统方法和比较粗放的分子生物学方法，如平板稀释计数法、显微镜测数法、浊度测定法、流式细胞计数法。平板菌落计数法[18]是最经典的细菌计数方法，需要培养活菌，操作简单、结果稳定，但只能从菌落的形态、颜色等方面初步辨别真菌与细菌。显微镜测数法[19]是利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里微生物的数量，快速、准确，但不能区分死菌或活菌，不适于对运动细菌的计数，需要较高的细菌浓度，且仅能根据染色后颜色和形态等对细菌做大致的分类。流式细胞计数法[2021]也能够一定程度上鉴定细菌，但是无法鉴定到种水平。16S rRNA扩增子测序[2223]既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，但有的菌种由于属内/种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种水平。Patro等[24]构建了一个名为FDA GutProbe高效可靠的平台，使用DNA微阵列芯片法鉴定膳食补充剂中微生物成分的存在并确定其差异。但这些常用的方法只是定量测定细胞浓度的方法，无法对微生物进行物种的鉴定，这是传统方法的局限性。

宏基因组测序[25]可分析特定环境微生物群体基因组成及功能、菌群的多样性与丰度，可以鉴定出混合环境中包含有哪些菌株，精度可鉴定到菌株水平。Patro等[26]运用宏基因组测序技术鉴定膳食补充剂样品中微生物活菌，用kmer方法计算其丰度，可快速有效地识别各种膳食补充剂样品中物种水平，确定这些产品中特定污染物的存在。因此，宏基因组测序技术应用于检测益生菌产品的菌株组成有其不可替代的优势。本实验采用宏基因组测序技术，分析市售10种益生菌产品的菌种组成，为我国益生菌产品的质量监控探索一种新方法。

1材料与方法

11主要试剂与仪器

天根粪便基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司;柏尔快速建库试剂盒（货号：514402）;Ampure XP磁珠，Beckman公司;微量核酸定量仪（ND1000 型），美国Nano Drop 公司;PCR 仪（2720 型），美国 Applied Biosystems 公司;电泳仪（PowerpacTM基础型），美国 BIORAD 公司;凝胶成像系统（Alpha Imager EP通用型），美国 Alpha Innotech 公司;离心机（Z216 MK 型），德国 HERMLE 公司;超声破碎仪（Bioruptor）;Mini Bead beater16（607EUR型），购于美国BioSpec公司。

12益生菌产品和微生物基因组DNA提取

从京东商城采购10 种市面上常见的益生菌产品，实验时产品均在保质期范围内。对于10种产品，均于同一批次内分别随机抽取2份独立小包装，作为实验重复。使用天根粪便基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取：称取（200±5） mg益生菌产品干粉至2 mL离心管中，置于冰上。称取03 g直径01 mm 的玻璃珠，向样本中加入14 mL缓冲液GSL，用bead beater 振荡2 min。用95 ℃、900 r/min振荡孵育10 min。涡旋15 s。12 000 r/min离心1 min。然后按照天根粪便基因组DNA提取试剂盒的标准流程进行DNA提取。DNA 提取结果用 1% 琼脂糖凝胶电泳100 V、60 min，通过凝胶成像系统进行检测。

13微生物DNA浓度检测

使用Nano Drop核酸浓度测定仪，按照使用说明书，分别取以上益生菌产品提取得到的DNA 洗脱液 1 μL 加样于检测区，读取DNA的浓度。浓度要求不少于10 ng/μL。

14測序文库的构建及质控

取20 μg微生物宏基因组DNA，使用柏尔快速建库试剂盒构建测序文库。具体步骤如下：取检测合格的20 μg DNA样品，用Bioruptor仪器随机打断成长度约为350 bp的片段，再用磁珠纯化，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，使用Qubit 20进行初步定量，稀释文库至2 ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测，使用qPCR方法[27]对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>3 mmol/L），以保证文库上机质量。

15测序

将构建好的文库在Illumina Hiseq 2500平台上机进行测序。

16物种注释

使用MOCAT[28]预处理过滤低质量序列、过短序列以及错误序列，得到有效数据。从各样品质控后的有效数据出发，进行Metagenome组装[29]。从gene catalogue出发，用bowtie把序列和MicroNR库进行比对，获得Unigenes的物种注释信息，并结合基因丰度表，获得不同分类层级的物种丰度表。

2结果与分析

21所检测到的菌株总览

根据Metagenomic测序生成的进化分支图，本次检测的益生菌产品中所测出的菌株，分属于11个科、11个属、22个种，其中益生菌集中在2个属—双歧杆菌属（Bifidobacterium）和乳酸杆菌属（Lactobacillus），其他益生菌还包括链球菌属（Streptococcus）。肠杆菌属、肠球菌属、分枝杆菌属等为产品中痕量的微生物污染。

22所检测到的菌种与产品说明的对比

在市场上所随机抽取的10种益生菌产品名称以字母代号表示。如附图所示，所检测的10种益生菌产品中，只有代号为TCBJ和DMKHS的两个产品的检测结果和产品标注完全相同，且两次抽检检测到的菌种组成完全一致。其他产品均不达标，表现为缺失产品说明中所列示的菌种，或者含有产品说明中未标示的菌种。10种益生菌产品中，菌种组成的合格率仅为20%。

23分析

市场上的益生菌产品主要包括乳制品、粉剂、片剂等，本次实验的产品主要是粉剂、片剂、胶囊，近年来这些产品作为补充身体益生菌的主要膳食补充剂而广受推崇。10种市售的益生菌产品中的菌种大多属于乳酸杆菌属和双歧杆菌属，其中用的最常见的是嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）。本实验中，通过宏基因组测序检测出最多的菌种是鼠李糖乳杆菌（Lctobacillus rhamnosus）和动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）。总体上，本次检测的产品存在较为突出的问题，10个产品平均有1～2个标注的益生菌种未检测到，其中代号为HSYP的产品标注为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），而检测到的全部为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）;所有产品包装都没有标注的菌种玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae）在两个产品中检测到，且在BSY中为主要益生菌组分;个别产品（代号BSY）益生菌没有污染的杂菌丰度高，两次重复测定中益生菌比例仅占285%～32%。部分非产品标注的乳酸菌的出现，可能是由于生产企业为了延长保质期限，将某些可以产生细菌素的乳酸菌如副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ）等作为食品添加剂导致的[30]。中国目前市场流通的益生菌产品质量良莠不齐，生产企业对微生物的菌种鉴定水平与生产管理水平亟待提高。

3结论

使用宏基因组测序技术对我国益生菌产品质量进行评价发现，益生菌产品市场存在着不规范和安全隐患的问题，可以利用高通量测序的新技术来对国内益生菌产品市场进行监管。益生菌厂家生产时应使用符合国标的具有明确编号的菌株，保证生产、包装环境无菌，保证消费者的权益。◇

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