药用石斛内生菌的研究进展

王珊珊 刘佳萌 孙晶 贾宁 范蓓 戴小枫

摘 要：综述了药用石斛内生菌的分离鉴定以及与宿主互作关系等方面的国内外研究进展。在介绍药用石斛内生真菌、内生细菌的基础上，结合本课题组前期对石斛内生细菌做出的相关研究工作，对其研究发展思路进行了展望，为开发安全有效的微生物菌肥、中医药产品、新资源功能性食品，合理利用药用石斛资源提供科学依据。

关键词：药用石斛;内生真菌;内生细菌

石斛（Dendrobium）属兰科植物，全球现存约1 500种，其中仅中国华南及西南地区就分布有近80种。石斛不仅闻名于其较好的观赏性，许多种类还具有极高的药用价值，中国石斛属植物已超过50余种被认定为有药用价值[1]。本文将药典里已有明确规定用作药用、传统用作药用、相关研究证明具有药用疗效的石斛统称为药用石斛。在我国传统医学中，石斛属多种植物的新鲜或干燥茎被收做药用，具有极高的药用价值，如铁皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、金钗石斛（Dendrobium nobile）和流苏石斛（Dendrobium fimbriatum）等[2]。《神农本草经》最早对石斛记录其 “味甘，平。主伤中;除痹，下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴。久服厚肠胃;轻身延年”，其被历代医家视为珍品，民间甚至称其为 “九大仙草”之一[3]。据2015版《中国药典》记载，石斛味甘，微寒;归胃、肾经。益胃生津，滋阴清热，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软[4]。现代医学的大量研究表明，石斛中含有丰富的氨基酸、生物碱、多糖、酚类等活性成分，具有很好的降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫等功效[5]。研究表明，药用植物与众不同的次级活性代谢物极有可能与其相关微生物群落的高特异性有关[6]。一些从药用植物中分离出的特定内生菌可产生与宿主植物相同或相似的活性功能，或者对药用植物的一些致病菌具有较好的抑制效果[7-8]。国内外研究人员在药用石斛内生菌的分离鉴定以及与宿主互作关系等方面已作了一些相关的研究。药用石斛在其生活史中与内生菌经过长期的协同进化，彼此构成了稳定的生态关系。药用石斛内生菌分泌的次级活性代谢物会对石斛的生长发育产生刺激作用，进而提高宿主石斛对生物胁迫以及非生物胁迫的抵抗能力;与此同时，内生菌也可从宿主石斛中吸取养分以供自身生长所需。本文对药用石斛内生菌进行综述，为开发出安全有效的微生物菌肥、中医药产品、新资源功能性食品，合理的利用宝贵药用石斛资源提供科学依据，并针对该领域存在的主要问题提出解决方案。

1 药用石斛内生真菌

1.1 药用石斛内生真菌研究概况

近年来，内生真菌因其较为丰富的生物组成多样性及次生代谢产物多样性，已成为寻找具有生物活性成分的重要来源，并引起众多研究者的关注。目前，已有对以下药用石斛内生真菌进行研究的报道：铁皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、美花石斛（Dendrobium loddigesii）、金钗石斛（Dendrobium nobile）、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）、齿瓣石斛（Dendrobium devonianum）、束花石斛（Dendrobium chrysanthum）、流苏石斛（Dendrobium fimbriatum）和华石斛（Dendrobium sinense）等少数具有较高经济价值的种类。其他品种石斛涉及较少，对内生真菌与宿主石斛互作机理的研究也鲜有报道[9-18]。药用石斛内生真菌的种群存在丰富的多样性，其主要分为三大门类：子囊菌亚门（Ascomycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）和半知菌亚门（Deuteromycotina），包括炭角菌科（Xylariaceae）、伞菌科（Agaricaceae）以及丛梗孢科（Moniliaceae）等约25个科，小菇属（Mycena）、木霉属（Trichoderma）以及柱孢霉属（Cylindrocarpon）等约57个属[19-21]。虽然已经分离鉴定出的药用石斛内生真菌种类相对较多，但对比于丰富的药用石斛资源来说，内生真菌多样性的研究还远远不够。

药用石斛内生真菌在宿主中的分布存在特异性。前人研究表明，药用石斛内生真菌的分布受组织、宿主、环境等因素的影响，进而体现出一定的组织、宿主、生境特异性。洪群艳等 [22]通过组织分离法对从云南采集到的8种野生石斛中的内生真菌进行分离、鉴定以及分布组成研究，结果发现，不同种的石斛内生真菌分布情况具有较大差异，呈现出一定的宿主特异性;根、茎、叶中内生真菌的分布差异性也极其显著，说明内生真菌定殖具有组织特异性。毛益婷等[23]对采集自湖南省新宁县崀山、广西省乐业县雅长两个不同生境下，相同生长期铁皮石斛根组织中的内生真菌进行分离、鉴定，结果表明，雅长野生铁皮石斛内生真菌多样性明显高于崀山。其中，胶膜菌属（Tulasnella）和柱孢霉属（Cylindrosporium）为崀山所特有，拟盘多孢霉（Pestalotiopsis）為雅长所特有。由此可见，不同生境下野生铁皮石斛内生真菌的多样性存在一定的特异性。陈玉栋等[24]、胡克兴等[25]、董飞[26]研究表明，铁皮石斛根部和茎部的内生真菌丰富度要明显高于叶片，特别是在根中内生真菌资源最为丰富。陈晓梅等[10]研究表明，美花石斛根部内生真菌多样性明显高于茎和叶，此结果与铁皮石斛相一致。然而，柴晓蕾等[11]对海南华石斛野生植株内生真菌的研究结果表明，叶中分离出的菌株数最多。由此可见，不同品种的药用石斛内生真菌的分布以及数量存在一定的差异性，也或是因为目前多采用组织分离法进行内生真菌的分离，其中的分离培养基、消毒程序、人为操作、培养条件等因素也会造成菌株分离结果的差异。内生真菌与宿主的互作关系研究甚少，尚不明朗，多为推论性或间接性的结果。因此，在未来的药用石斛内生真菌的研究中，可通过结合高通量测序等DNA分析技术，例如构建不同品种药用石斛内生真菌的cDNA文库等，快速筛选内生真菌。

1.2 研究药用石斛内生真菌的重要性

1.2.1 内生真菌对药用石斛种子萌发以及植株生长的影响 现有研究表明，内生真菌在药用石斛的生长发育和系统演化过程中起着至关重要的作用。黄晖等[9]采用单菌丝团分离法对齿瓣石斛根组织中的内生真菌进行分离、鉴定，共得到内生真菌6株，将其分别与齿瓣石斛无菌幼苗共生培养。结果发现，FDdS-5菌株对幼苗株高、干重、鲜重、根数和茎粗都表现出显著的促进效果，FDdS-9菌株只对无菌苗的株高具有显著的促进作用。随后，孟娉等[27]利用注射器接种法分别将上述两种菌株的单一菌剂以及混合菌剂注射接种到松树皮基质上与铁皮石斛幼苗进行共生培养，结果表明，FDdS-5和FDdS-9均能对铁皮石斛幼苗生长表现出显著的促进作用。同时，混合菌剂接种组与单菌株接种组相比，对石斛幼苗生长的协同效应更加明显。由此可见，齿瓣石斛的促生真菌同样能对铁皮石斛幼苗的生长具有促进作用，混合接种可能会更大地发挥微生物的效能。近几年来，已有相关研究陆续报道了内生真菌对铁皮石斛、金钗石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛、华石斛、霍山石斛、美花石斛和细茎石斛等具有促生作用[17，28-31]。关于药用石斛内生真菌对宿主的促生机制已有相关的研究报道。马昭[32]初步研究了具有促生作用的内生真菌对铁皮石斛转录水平的影响，发现内生真菌感染铁皮石斛无菌苗后宿主植物在一系列代谢途径上均发生了基因差异表达。其中，NT66G01、NT04Y01两菌株具有使宿主植物生长相关代谢通路基因表达明显上调的作用。X B Xu等[33]利用二维电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定了与石斛小菇共生栽培的铁皮石斛根系蛋白，共鉴定出41种被石斛小菇诱导产生的蛋白质。其中，10种参与了植株的防御和应激反应、2种参与了根系的形成、3种参与了宿主植物活性成分的生物合成。赵英梅[34]对石斛小菇侵染金钗石斛前后基因水平的变化进行了初步探索，发现CI-通道蛋白、生长素跨膜蛋白、肽合成酶合成代谢途径的一些重要基因，比如Unigene65712、Unigene65407、Unigene68656等上调倍数达到15倍以上，推测可能参与了石斛菌根的建立过程。虽然已有大量研究表明，药用石斛内生真菌能促进宿主植株的种子萌发和幼苗生长，但还需要研究者对药用石斛与内生真菌之间的共生机理研究透彻，以便为开发出绿色安全的微生物菌肥以及药用石斛的仿生态栽培提供理论技术支持，从而更好地利用宝贵的药用石斛资源。

1.2.2 内生真菌对药用石斛化学成分和药理活性的影响 自Stierle A等[35]从植物内生真菌中发现抗癌药物紫杉醇以来，内生真菌作为一种新的天然产物和生物活性物质的重要来源而备受关注。研究表明，内生真菌在与药用石斛互相依存的过程中，会对药用石斛的化学成分以及药理活性产生一定的影响。内生真菌对药用石斛化学成分和药理活性的影响主要从以下两种途径进行：（1）内生真菌可刺激宿主植物的代谢活动，进而提高其次级代谢产物的含量，增强其药用效果。陈晓梅等[36]研究表明，在内生真菌与金钗石斛共生培养条件下，不仅能促进金钗石斛的生长，而且还能提高金钗石斛总生物碱和多糖的含量。罗在柒等[37]测定了3株内生真菌的分泌物对金钗石斛超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和氧化物酶（POD）活性的影响，结果发现，这3株内生真菌分泌物均能诱导金钗石斛的酶活性增强。赵英梅[34]在对石斛内生真菌互作分子机理的研究中发现，其共生体系能促进金钗石斛组培苗生物量的积累。（2）内生真菌自身或可产生与宿主植物相同或相似的药用活性产物。Sujit Shah等[17]对从细茎石斛中分离出的内生真菌进行研究发现，R10能产生相对较高的吲哚乙酸（IAA）。同时，利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）在R11和R6的有机提取物中观察到酚类化合物和挥发油的存在，推测它们或许对寄主植物的抗菌和抗氧化性具有一定的影响。

1.2.3 药用石斛内生真菌的抗菌活性 已有相关研究表明，药用石斛内生真菌对一些石斛病原菌具有很好的抑制效果，是获取天然抗菌活性物质的有效途径。张丽春等[38]从5 种云南产石斛属植物中分离得到内生真菌155 株，其中48 株真菌對枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等6种病原菌中的至少1种具有抑制效果。周琢艳等[39]通过抑菌实验发现，分离自铁皮石斛的28 株内生真菌中，有7 株能对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的至少1 种表现出抗菌活性，其代谢产物的醋酸乙酯萃取相对3种指示菌及人肝癌细胞HepG2具有不同程度的抑制效果。除此之外，还有不少研究已证实，从药用石斛植物中分离得到的内生真菌对多种病原菌呈现出良好的抗菌活性[11，26，30，40]。尽管这些内生真菌的抗菌活性成分以及作用机制尚不明确，但不可否认的是，这为今后获得天然抗菌活性物质和研发新型抗生素药物提供了宝贵的真菌资源。

1.2.4 药用石斛内生真菌的其他作用 随着现代科学研究技术的发展，对于药用石斛内生真菌的研究已扩展到了其他各个研究领域，内生真菌的作用也正在被一步步挖掘出来。刘小莉等[41]从石斛中分离得到一株内生禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）DO-1，其菌体在去离子水中浸泡后分泌的代谢产物与硝酸银作用后，能还原银离子产生具有抗菌作用的纳米银粒子。相子春[42]对从药用植物铁皮石斛根组织中分离出的一株瘤菌根菌属（Epulorhiza sp.）真菌M1进行细胞毒理性实验，发现其可以显著降低感染细胞内的HIV-1 RNA含量，且M1对HIV-1感染的作用位点是在逆转录后到HIV RNA表达之前，为一类新型的具有调节HIV-1基因表达作用的药物。Ling-Shang Wu等[43]从铁皮石斛内生真菌DO14代谢产物中分离到对人癌细胞（LOVO细胞、HL-60细胞）具有不同程度抑制效果的5种化合物。刘维等[44]研究发现，铁皮石斛内生真菌H1B1可产生适用于高糖高盐环境的水溶性胞外红色素，是天然功能色素的潜在来源之一。由此可见，药用石斛内生真菌具有巨大的应用潜能，亟需科研人员对其进行多方面、多广度、深层面的研究。

2 药用石斛内生细菌

2.1 药用石斛内生细菌研究概况

对药用石斛内生菌的研究开始于内生真菌，近年来对内生细菌也开始了陆续的研究，但多采用传统的分离培养基筛选法。现将已分离鉴定得到的可培养内生细菌进行了整理汇总，包括放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），包括芽孢杆菌科（Bacillacea）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）以及假单胞菌科（Pseudornonadaceae）等约27个科，芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）以及赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）等约40多个菌属[45-56]。传统的筛菌方法通常只能筛选到约1%的内生细菌，这不利于内生细菌的综合研究。近年来，分子生物学方法已经在药用石斛内生细菌的鉴定上开始应用。Cong Pei等[47]利用传统的内生菌分离法、聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）和宏基因组方法对铁皮石斛的内生细菌进行比较分析研究。结果表明，在内生细菌鉴定方面，传统的培养方法存在一定的局限性;PCR-DGGE方法可以给出较详细的结果;而宏基因组方法可以提供完整透彻的分析。本课题组前期通过结合微生物多样性分析（MiSeq高通量测序）及传统的内生菌分离法对分别采集自中国湖北省英山县和中国安徽省霍山县的米斛（Dendrobium huoshanense）、铜皮（Dendrobium moniliforme）、铁皮（Dendrobium officinale）等6个不同种的石斛茎内生细菌进行分析研究。结果表明，从门水平上看，微生物多样性测序分析检测到了传统的内生菌分离法未检测到的拟杆菌门（Bacteroidetes）;从属水平上看，传统的内生菌分离法分离得到20个菌属，而微生物多样性测序分析得到373个菌属，其中15个菌属的相对丰度超过1%。同时，传统的内生菌分离法分离得到的菌属都已被发表报道过，而微生物多样性测序分析可以检测到未被报道过的从石斛中分离出的一些菌属，比如罗尔斯通菌属（Ralstonia）、丛毛单胞菌属（Comamonas）以及Lelliottia[48]。因此，有必要使用多相方法来对“可培养和不可培养的内生菌”进行全面的分析研究。

药用石斛内生细菌在宿主中的分布与内生真菌类似，也存在一定的组织、宿主、生境特异性。本课题通过微生物多样性分析（MiSeq高通量测序）对英山米斛、英山铜皮、英山铁皮以及霍山米斛、霍山铜皮、霍山铁皮6个不同品种、不同产地的石斛茎组织内生细菌进行了比较分析。结果表明，石斛茎组织内生细菌组成及相对丰度具有宿主、生境特异性：从品种来看，铁皮大于铜皮，米斛内生细菌菌群丰富度最小;从产地来看，霍山石斛内生细菌菌群多样性明显高于英山石斛，而且产地差异对药用石斛内生细菌菌群的影响高于品种差异，这也侧面反映了药材的道地性[48]。王明月等[51]对人工种植2 年的铁皮石斛根、茎和叶中的内生细菌进行分离、鉴定，结果表明，铁皮石斛根组织中分布的内生细菌数量明显高于茎和叶，其中苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）只在根中分离鉴定得到，进而推测土壤或许是铁皮石斛中内生细菌的重要来源;同时，铁皮石斛不同部位的内生细菌菌群组成存在一定的差异性，菌群种数为根>茎>叶。吴庆珊等[46]采用9 种不同培养基对采集自3个不同产地的金钗石斛根组织、茎组织和叶组织中的内生细菌分离、鉴定，结果表明，金钗石斛内生细菌的组成多样性受其产地和组织的影响。在3个样地的金钗石斛中，P1 样地的金钗石斛内生细菌丰富度指数Margalef明显高于P2、P3 样地，芽孢杆菌属（Bacillus）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）为3 个不同产地金钗石斛内生细菌中的优势菌属;其中，根部内生细菌菌株最多，其内生细菌丰富度指数Margalef（5.81）和多样性指数Shannon-Wiener（2.20）均高于茎（2.39，1.57）和叶（2.18，1.71）。陈泽斌等[57]利用Illumina测序平台的MiSeq高通量测序技术对铁皮石斛不同组织中内生细菌的组成分布进行了生物信息学分析。结果表明，内生细菌的丰富度为叶>根>茎，经序列比对发现根、茎、叶中的优势菌属为食酸菌属（Acidovorax）和假单胞菌属（Pseudomonas），另外，还检测到少许没有被分离鉴定过的低丰度内生细菌类群（占比低于10.00%），如瘤胃球菌属（Ruminococcus）、布赫纳氏菌属（Buchnera）等。而通过传统组织分离方法对药用石斛内生细菌进行分离鉴定的研究表明，优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus），而且从根部分离出的内生细菌丰度最高。这进一步显示出了新一代测序技术的优势，传统的组织分离方法具有一定的局限性，分离出的大多数是较活跃的较少部分内生细菌。同时，芽孢杆菌属（Bacillus）细菌在植物体内大多是以孢子的形式存在，但目前提取植物组织DNA多采用十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）法，不能使其裂解，进而未能获取到该菌属细菌的基因组DNA。由此可见，在未来的药用石斛内生菌的研究中，通过结合传统的组织分离方法和微生物多样性免培养分析方法，可为研究内生菌提供强有力的技术支持，这将有助于我们识别和獲得一些新的或难以分离筛选的内生菌株。

2.2 研究药用石斛内生细菌的重要性

通过传统组织分离法对药用石斛可培养内生细菌进行分离筛选研究发现，芽孢杆菌属（Bacillus）细菌所占比例最高，说明该属细菌在药用石斛生长史中发挥着至关重要的作用。同时，芽孢杆菌属（Bacillus）因其能分泌多种天然代谢产物而成为研究的热点，具有较强的促进植物生长、防治植物病虫害和增强植物抗逆性等作用，并能在不利的环境条件下生存很长时间，具有很大的发展潜力[58]。童文君等[52]对不同产地美花石斛的内生细菌进行分离、鉴定以及促生能力的研究，结果发现，隶属于芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）的8株内生细菌菌株兼具解无机磷、解有机磷、解钾以及分泌生长素的特性。杨绍周等[53]从鼓槌石斛中分离筛选得到具有生防功能的4株芽孢杆菌属（Bacillus）菌株和1株链霉菌属（Streptomyces）菌株、具有解磷功能的1株肠杆菌属（Enterobacter）菌株和1株不动杆菌属（Acinetobacter）菌株、具有固氮功能的1株克雷伯氏菌属（Klebsiella）菌株。高阳等[59]从金钗石斛中分离得到能产生IAA的芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）内生菌株，其菌株发酵上清液对玉米种子进行浸种处理后，可有效缓解高度干旱胁迫对其种子萌发的影响，其中有7株内生细菌的发酵上清液可显著提高玉米种子的萌发率。何劲等[60]从金钗石斛茎组织中分离得到一株芽孢杆菌属（Bacillus）菌株DEB-2，结果表明，该菌株能同时对5 种辣椒病原真菌菌丝的生长和孢子萌发表现出显著的抑制效果，具有一定的生防潜力。本课题组通过传统的内生菌分离法从6个不同种的石斛茎组织中共分离出内生细菌165株，通过16S rRNA基因序列比对分析，分属于20个菌属，43个菌种。其中，短小杆菌属（Curtobacterium，44%）和芽孢杆菌属（Bacillus，18%）所占比例最高。对这43株菌种进行体外发酵萃取，并进行抑菌活性筛查，主要针对1种石斛病原细菌—果胶杆菌属（Pectobacterium carotovorum subsp.Actinidiae）、2种石斛病原真菌—罗尔阿太菌（Athelia rolfsii）和露湿漆斑菌（Myrotheciuum roridum），其中有14株内生细菌对至少一种指示病原菌具有抑制效果，分属于9个菌属，其中207号菌株—巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，相似率100%）对3种指示病原菌均有很好的抑制活性[48]。

综上可见，虽然目前对药用石斛内生菌的研究多集中于内生真菌，对于内生细菌的研究涉足较少。但是从已发表的研究结果来看，药用石斛的内生细菌也具有很大的发展潜力，特別是作为研究热点的可培养内生细菌菌株—芽孢杆菌属（Bacillus），是获得天然抗菌活性物质及开发绿色菌肥的又一重要资源;同时，通过结合免培养测序技术，设计特定培养基培养稀有菌属菌株，也是一个开发活性功能物质的有效途径。

3 结论与展望

药用石斛内生菌可通过多种途径增强石斛的营养及生理和抗性机能，但有关内生菌与宿主石斛之间互作机制的研究尚不明确，限制了药用石斛内生菌在生产上的应用。此外，因药用石斛内生菌种类较为繁多，体内外所处环境复杂，目前对于药用石斛内生菌尚处于单一菌株的研究阶段，对混合菌株协同作用机制的研究还相对较少。尽管如此，在自然条件下，药用石斛内生菌在宿主石斛种子萌发、营养物质供给以及促进幼苗生长中起着不可替代的作用，对宿主植物的病原菌也具有一定的抑制效果。作为药用石斛药用活性成分筛选的重要来源，药用石斛内生菌应用前景十分广阔，笔者建议未来药用石斛的研究可从以下几个方面着手：

（1）结合传统的组织分离法和新一代的分子生物测序分析技术对不同产地、不同品种的药用石斛内生菌进行全面的深入挖掘研究，获得一些有效的分离和检测内生菌的方法;

（2）从分类学的角度研究药用石斛内生菌及宿主植物的整个微生态环境，丰富菌种资源库;

（3）通过结合微生物组学以及代谢组学技术，探究药用石斛内生菌与其具有药理活性的次级代谢物之间的关系，进而提高药用石斛的药理效用;

（4）筛选出能产生与药用石斛相同或相似生理活性成分或其他新的活性成分的内生菌，并进一步结合生物发酵技术进行大规模的生产，可有效地解决药用石斛资源稀缺、药用受阻等问题;（5）通过分子生物技术寻找药用石斛内生菌中相关的功能基因，进一步选择并克隆其相关功能基因进行表达，以便高效、大量地获得药理活性成分;此外，或可将药用石斛内生菌作为外源基因载体，将某些特定基因导入内生菌中，这样既可以增强宿主植物的抗性或提高其产生某种特殊活性物质的能力，又保持了药用石斛自身的基因和天然性状。

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