黄草乌根部内生真菌的分离与鉴定

尹田鹏+俞静+王家鹏

[摘要] 目的 从黄草乌的根部分离鉴定内生真菌。 方法 利用PDA培养基进行黄草乌根部内生真菌的分离与纯化，根据菌落的形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定。 结果 从黄草乌根部共分离到内生真菌52株，鉴定为20属34种，绝大部分属于子囊菌门，其中镰刀菌属和青霉菌属为优势属。 结论 黄草乌根部的内生真菌具有多样性，可作为潜在的资源供药物筛选。

[关键词] 黄草乌；内生真菌；镰刀菌属；青霉属

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0009-04

[Abstract] Objective To isolate and identify the entophytic fungal in the roots of Aconitum vilmorinianum. Methods PDA medium was used to isolate and purify the endophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum. The purified strains were identified by morphology together with ITS sequence. Results Fifty-two strains of endophytic fungi were isolated and identified belonging to 34 species， 20 genera. Most of the isolated fungi are belong to the Ascomycota. Fusarium and Penicillium are the dominant families. Conclusion The entophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum are diverse， which can serve as potential resource for drug screening.

[Key words] Aconitum vilmorinianum； Entophytic fungal； Fusarium； Penicillium

黄草乌（Aconitum vilmorinianum Kom.）是毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物，俗称大草乌、昆明乌头，主要分布在云南中部、四川会理及贵州西部，生长于海拔2100～2500 m间山地灌丛中。黄草乌在云南素有“大补药”之称，是云南白药的主要原料之一，可治跌打损伤、风湿等症[1-2]。黄草乌野生资源丰富，且易栽培，已有人工种植基地。黄草乌根部富含二萜生物碱成分[3-4]，该类成分具有复杂的化学结构和显著的药理活性[5-7]。

植物内生真菌（endophyte fungi）是非常重要的微生物资源，几乎所有植物组织内都存在内生真菌，其发酵产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性[8-9]。自Strierle等[10]发现红豆杉的内生真菌紫衫霉可产紫杉醇后，引发了利用内生真菌来替代原植物的研究热潮。很多植物中都发现了能够产和宿主相同结构的活性次生代谢产物的内生真菌，如白喉乌头根部的内生真菌芽枝状枝孢（Cladosporium cladosporioides）可产乌头碱[11]。为保护黄草乌野生植物资源，缓解我国中药资源日益减少与需求量不断增加之间的矛盾，本研究对黄草乌根部的内生真菌进行了分离与鉴定，为黄草乌的中药资源保护和开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄草乌新鲜健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盘龙区，由昆明医科大学杨淑达副教授鉴定，标本（2015-yc-1）保存于云南大学化学科学与工程学院。葡萄糖、琼脂粉、NaClO购于上海泰坦科技股份有限公司（上海），青霉素及卡那霉素购于阿拉丁（北京），酒精购于天津化学试剂有限公司（天津）。

1.2 内生真菌的分离与培养

1.2.1 分离培养基 PDA培养基：去皮马铃薯200 g煮沸30 min，加入葡萄糖20 g，琼脂粉12 g，纱布过滤，滤液定容至1000 mL，pH自然，121°C灭菌30 min。

1.2.2 分离与培养 黄草乌的根用自来水冲洗干净，截成6～8 cm长条，晾干水分后于5% NaClO溶液漂洗60 s，无菌水冲洗三次，然后于75%酒精漂洗60 s，最后无菌水冲洗三次则表面消毒处理完毕。无菌状态下将根切成2 mm3小块，置于分离平板培养基（28±1）°C静止培养，培养基需预先加入青霉素（100 mg/L）和卡那霉素（100 mg/L）以抑制细菌生长。3～7 d后培养基中可见菌落形成，挑取组织周围的菌落转接入PDA斜面。采用平板梯度稀释法纯化分得的内生真菌，根据其主要菌落形态特征（菌落大小、颜色、表面特征和质地）和菌体个体形态特征（菌丝、子实体和孢子形态），按微生物分类的不同将同一类群进行归类。最后将已纯化和归类的菌株分别转入PDA斜面，在（28±1）°C下培养。

1.3 内生真菌的鉴定

采用插片培养方法对分离的内生真菌进行显微形态特征的观察、鉴定，在显微镜下观察子实体特征，结合培养特性，将菌株鉴定到属。然后依据不同属的分类标准，参照文献的方法进行种的鉴定[12]。

1.4 分子生物学信息分析

在PDA平板上恒温培养内生真菌5 d后在无菌条件下用刀片刮取菌丝至1.5 mL离心管收集菌丝体。在研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，立即装入1.5 mL离心管中，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20°C冰箱中保存备用。提取基因组DNA后，用引物ITS4进行扩增，扩增产物交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对。

2 结果

从黄草乌的根部共分离得到52株内生真菌，经形态学和ITS分子测定鉴定为20属34种见表1。从表1中可以看出，分离得到的黄草乌的根部内生真菌绝大部分分布在子囊菌门（Ascomycota）（44株29种）。子囊菌门的菌株在纲、目、科、属等分类水平上具有丰富的多样性，分离鉴定的真菌包括子囊菌门的4纲、7目、9科、16属，其中地丝霉属（Geomyces）和漆斑菌属（Myrothecium）在科的水平上未分类[13]。属于接合菌门的菌株仅有4株2种，都为接合菌纲毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌属。另外有4株3种的真菌属于担子菌门，分布于担子菌门的1纲、2目、3科、3属中。在纲的分类水平上，粪壳菌纲有24株，占分离总数的46.2%，包括10属13种。其次为散囊菌纲，有15株，包括2属12种。在目的分类水平上，优势目为肉座菌目，具有18株9种的内生真菌，其次为散囊菌目，有15株12种。丛赤壳科和发菌科为黄草乌的优势菌群，分别有14株6种和15株12种。从属的层面上看，镰刀菌属共分离得到12株4种，是黄草乌内生真菌的优势属种；其次是青霉菌属，有11株9种，曲霉属有4株3种见表2。

3 讨论

李治滢等[14]曾报道从黄草乌的根和茎中分到12个属的内生真菌，主要有镰刀菌属、毛壳菌属（Chaetomium）、黑孢属和青霉属等。本研究对黄草乌根部内生真菌菌群的分析，从中鉴定了19属34种的内生真菌，其中有14属的真菌首次从黄草乌中分离得到。

本研究所得黄草乌根部的内生真菌类群普遍被认为腐生性较强，但是所采集的样本全部来自健康植株，宿主未表现受到伤害或感染病害的症状，应该不会给腐生性真菌提供生长基质。因此认为这些真菌是内生的或至少是部分内生且不引起植物病害，它们符合植物内生真菌的有关定义[15-16]。本研究还发现镰刀菌属是黄草乌根部内生真菌的优势属种，在本实验中分离得到的4种镰刀菌属的真菌：腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、三隔镰刀菌（Fusarium tricinctum）尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. ciceris）均被报道能引起植物病害[17-18]，可以认为是潜伏的致病菌。本研究中亦从黄草乌中分离得到芽枝状枝孢，该菌曾被报道可产生二萜生物碱类化合物乌头碱，本研究所分离得到的芽枝状枝孢是否能在一定的培养条件下产生二萜生物碱则有待进一步研究。

结合文献报道及本研究的结果，表明乌头属植物中的内生真菌具有丰富的多样性[19-20]。内生真菌的次生代谢产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性，乌头属植物内生真菌可作为潜在资源供药物筛选。对黄草乌内生真菌的活性代谢成分进行系统而深入的研究，有利于保护植物资源、开发新型药物，我们将在今后的工作中有针对性地进行菌株的活性筛选和成分分离。

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（收稿日期：2016-07-15 本文编辑：赵鲁枫）