制川乌不同浸泡、蒸制时间比较与工艺优化

尹 磊，朱月健*，葛德助，杨国祥，李冬梅

(1.安徽普仁中药饮片有限公司，安徽 亳州 236800；2.中药提取安徽省技术创新中心，安徽 亳州 236800；3.安徽济人药业有限公司，安徽 亳州 236800；4.皖南医学院，安徽 芜湖 241000)

川乌为毛茛科植物乌头的干燥母根，始载于《神农本草经》，列为下品。本品初生发芽长出地面时，形如乌鸦之头，故名乌头。因主产于四川省，故又名川乌。6月下旬至8月上旬采挖，除去子根、须根、泥沙，晒干。其味辛、苦、热，有大毒。川乌主要有效成分为双酯型生物碱，其也是川乌的毒性成分。通过加热、水解等方式能使双酯型生物碱转变为毒性较低的单酯型生物碱，若进一步水解为相应的醇胺，则几乎无毒性[1]。因此川乌的合理炮制对控制用药安全有效尤为重要。

乌头属植物多含有生物碱，生药所含的双酯型生物碱具有较大的毒性，自古代即对其炮制过程有了较多记载，包括“炮”“烧”“泡”等方法。近代通过现在的设备和技术应用，对其炮制过程和原理也有了较多的研究，王峰峰等[2-3]对乌头碱、新乌头碱、次乌头碱水解和醇解产物进行分析，明确了乌头碱水解成单酯型新乌头碱，最后到次乌头碱的水解过程。秦语欣等[4]分析了川乌炮制前后化学成分的变化，也指出了生物碱水解过程。

对于乌头的炮制工艺研究，涂瑶生等[5]采用加压蒸制法炮制川乌，使其在111 ℃(0.05MPa)下炮制15～150 min即能达到药典标准。区炳雄等[6]研究表明，微波炮制能明显降低川乌中毒性成分双酯型生物碱的含量，与药典规定炮制方法比较，其总生物碱含量较高。龚潮池等[7]通过研究发现制川乌最佳浸泡方式为40 ℃温水浸泡25～26 h，可明显缩短制川乌浸泡时间。邓广海等[8]研究发现，高压蒸制30 min后，川乌毒性成分双酯型生物碱含量明显降低，且与蒸制时间有显著的相关性，时间延长，含量逐渐降低，到180 min后，其含量几乎检测不到，但是随着时间延长，总生物碱含量也有所降低。上述研究的工艺方法均为实验室小批量炮制过程，对于企业实际大生产工艺指导有一定的局限性，而且川乌炮制不当，即炮制程度不够(残留毒性太大)或炮制太过(有效成分流失)，使得市场上很多川乌炮制品的质量不达标，临床上时常发生川乌及制川乌中毒和疗效降低等现象[14]。因此本实验结合2015版《中国药典》标准、文献资料和饮片企业加工实际，进行工艺研究，通过工艺小试和大生产实际，探究制川乌蒸制时间、浸泡时间对有毒成分及有效成分的影响，形成稳定可靠的生产工艺。

1 材料与试剂

川乌药材(由安徽普仁中药饮片有限公司提供)，取自原料库，经安徽中医药大学谢冬梅老师鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根。

电磁炉(广东美的生活电器制造有限公司)、蒸锅(佳合不锈钢制品有限公司)、全自动平面往复式刨片机(亳州市姜氏制药设备有限公司)、UITiMate3000高效液相色谱仪(美国戴安(中国)有限公司)、电子分析天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)、GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)

苯甲酰乌头原碱对照品(批号：11794-201802)、苯甲酰次乌头原碱对照品(批号：11796-201803)、苯甲酰新乌头原碱对照品(批号：11795-201804)、乌头碱对照品(批号：112019-201801)、次乌头碱对照品(批号：110798-201809)、新乌头碱对照品(批号：110799-201708)，6种生物碱对照品购买于中国食品药品检定研究院；异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈和四氢呋喃为分析纯；超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃(25∶15)为流动相A，以0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235 nm。流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液制备

取对照品适量，精密称定，加异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL含乌头碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱各50 μg、次乌头碱和新乌头碱各0.15 mg、苯甲酰新乌头原碱0.3 mg的混合溶液，即得，备用。

2.3 川乌炮制方法考察

2.3.1 浸泡时间考察 分别取2批次生川乌大小分开，加水使其没过药材浸泡，每天换水1次，记录1次时间，记录总浸泡时间，取出蒸制7h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川乌。川乌浸泡时间对浸泡程度影响见表2。

表2 制川乌浸泡时间对浸泡程度影响

2.3.2 蒸制时间考察 取生川乌大小分开，用水浸泡至内无干心，记录浸泡时间，取出，分别蒸制4、5、6、7、8、9 h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川乌。每批次平行操作2次，得制川乌12批。

2.4 供试品溶液的制备

取制川乌粉末(过三号筛)约2g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz；水温在25 ℃以下)30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.5 精密度试验

精密吸取样品溶液20 μL，连续进样5次，记录峰面积、保留时间。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD(n=5)分别为2.80%、1.90%、2.04%、1.44%、2.47%、2.82%。保留时间的RSD(n=5)分别为0.43%、0.05%、0.84%、0.98%、0.95%、1.44%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一样品溶液，在室温下分别于0、2、4、8、10、24、48 h进样测定，记录峰面积、保留时间。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为2.76%、2.74%、1.90%、2.72%、2.60%、2.54%。保留时间的RSD分别为0.65%、0.51%、0.15%、1.10%、0.15%、1.31%。结果表明样品溶液48 h内稳定。

2.7 重复性试验

取样品粉末6份，分别按“2.4”项下方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液各20 μL，进行测定，记录峰面积、保留时间。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD(n=6)分别为1.87%、2.65%、1.99%、1.63%、1.93%、2.18%。保留时间的RSD(n=6)分别为0.20%、0.31%、0.29%、0.84%、0.13%、1.18%。结果说明该方法测定乌头中6种生物碱的重复性良好。

2.8 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表3、表4、图1、图2。

表4 不同蒸制时间对制川乌生物碱含量影响

表3 不同浸泡时间对制川乌生物碱含量影响

根据表3，绘制两批号制川乌单酯型生物碱成分的浸泡时间-含量关系，见图1。

图1 制川乌单酯型生物碱成分的浸泡时间-含量关系

本实验选取2个不同批号川乌进行实验，各个批号川乌均在浸泡3天(室温)后达到2015版《中国药典》内无干心的要求(表2)，由表3检测结果可见，8个批次浸泡不同时间所得制川乌双酯型生物碱和单酯型生物碱含量均在2015版《中国药典》规定范围内。

由图1可见，同一批号不同浸泡时间所得制川乌单酯型生物碱总量差距较小，说明浸泡时间对制川乌双酯型生物碱影响较小。根据企业实际生产情况考虑，制川乌浸泡3天符合2015版《中国药典》且能大大缩短生产制川乌成品时间。综上所述，企业生产制川乌室温浸泡3天应为最优参数。

根据表4绘制两批次制川乌单酯型生物碱成分的蒸制时间-含量关系，见图2。

图2 制川乌单酯型生物碱成分的蒸制时间-含量关系

由表4及图2可见，制川乌蒸制6 h后双酯型生物碱已经完全检测不到，说明双酯型生物碱在蒸制6 h后已经水解完全。制川乌中单酯型生物碱在蒸制7 h前呈逐渐升高趋势，蒸制7 h达到峰值，之后随蒸制时间延长逐渐降低。

蒸制6～8 h的川乌单酯型生物碱总量基本达到2015版《药典》所规定的0.070%～0.15%，说明2015版《中国药典》规定制川乌蒸制6～8 h的合理性。本项实验以单酯型生物碱为衡量标准，并明确了制川乌蒸制在7h单酯型生物碱总量达到最高。

2.9 验证实验

根据上述试验所得工艺参数，选取3个批号生川乌(批号1904111、1904112、1904121)进行大生产验证实验，每批平行操作2次，实验结果见表5。

表5 3批次制川乌生物碱含量测定结果

通过验证结果可知，3个批次制川乌符合2015版《中国药典》所要求的双酯型生物碱不得过0.040%，单酯型生物碱总量0.070%～0.15%。由实验研究得到的制川乌工艺参数在大生产中稳定可靠，可为企业批量生产制川乌提供参考。

3 讨论

生川乌毒性剧烈，必须经过炮制方能有药用价值。但针对制川乌2015版《中国药典》并未给出明确的炮制工艺参数。本文在2015版《中国药典》的基础上，运用高效液相色谱法测定制川乌中生物碱总量的多少，探究并优化了制川乌具体炮制工艺参数。

在蒸制时间上，本文对同一批号的川乌进行实验探究，从蒸制4 h开始，每隔1 h取样1次，取样到蒸制9 h，总计6个实验梯度。结果表明，制川乌在蒸制6 h后双酯型生物碱已基本检测不到，单酯型生物碱总量在蒸制4～7 h期间逐渐升高，7 h达到峰值，而后逐渐降低。原因可能是蒸制7 h之前川乌中双酯型生物碱不断转化为单酯型生物碱，从而使其不断升高；7 h后单酯型生物碱继续水解为醇胺类物质而没有双酯型生物碱继续转化。在此建议企业生产制川乌蒸制7 h最佳。

在浸泡时间上，本文根据2015版《中国药典》规定的“内无干心”进行浸泡，设置4个浸泡时间梯度，实验了2个不同批号的生川乌，结果表明川乌在浸泡3天后达到2015版《中国药典》所规定的“内无干心”标准，含量测定结果表明浸泡3天制川乌生物碱含量符合2015版《中国药典》标准，浸泡时间延长对制川乌生物碱含量影响不大。综合企业生产效率考虑，建议生产制川乌浸泡时间3天最佳。

综上所述，制川乌炮制最佳工艺参数为：去除杂质，于室温下加水浸泡3天，采用蒸制方法隔水蒸制7 h，切片，烘干即得。此工艺参数投入大生产中产出的制川乌性状、限量、含量都符合2015版《中国药典》标准，对制川乌的工业化生产具有指导意义。