正交试验优选艾纳香配方颗粒的提取工艺

蔡雪梅，王志萍，谢谭芳，陈 健，李林霜

（1.广西工业职业技术学院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.正大天晴药业集团股份有限公司，江苏 连云港 222002）

艾纳香为菊科艾纳香属植物艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.的干燥地上部分，别名为大风艾、牛耳艾等，具有祛风除湿、消肿止痛等功效［1-2］，民间常用于产后祛风除湿、杀菌止痒。中药配方颗粒具有免煎煮、携带方便、容易储存等优点［3-4］，是中药饮片发展的趋势。本实验以艾纳香的有效成分原儿茶酸的含量为考察指标，以提取次数、提取时间、加水倍量作为考察因素，采用正交试验法对艾纳香配方颗粒的提取工艺进行优化。

1 实验材料

1.1 仪器 SQP YJ-04、CPA225D 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；UPC-II-10T 超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；KQ3200B 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；98-I-B 电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；岛津LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津）。

1.2 材料 艾纳香药材购自南宁水街，经广西中医药大学田慧教授鉴定为菊科艾纳香属植物艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.的干燥地上部分；原儿茶酸对照品（批号110809-201205，含量为99.9%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原儿茶酸的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：美国Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92），采用等度洗脱；柱温为30 ℃；流速为0.8 ml/min；进样量为15µl；检测波长为256 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备 取原儿茶酸对照品适量，精密称定，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.145 mg/ml 原儿茶酸对照品溶液母液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取艾纳香药材粗粉约100 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入12 倍量水浸泡使药材充分湿润，浸泡90 min 后加热回流提取30 min，趁热使用400目滤布滤过；残渣再加入10倍水回流提取20 min，滤过，合并过滤液，再加水定容至一定体积，摇匀。取药液2 ml，离心15 min（13 000 r/min），将上清液用0.22µm 微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

2.1.4 阴性溶液的制备 取甲醇溶液2 ml，用0.22µm微孔滤膜滤过，滤液即为阴性溶液。

精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液各15µl，按“2.1.1”色谱条件进样，记录色谱峰。原儿茶酸保留时间为11.87 min，与供试品其他成分分离度良好（R＞1.5），阴性溶液对测定无干扰。见图1。

图1 原儿茶酸含量测定HPLC色谱图

2.1.5 线性关系考察 精密吸取2.0 ml原儿茶酸对照品溶液母液至25 ml的容量瓶中，加入甲醇稀释，配制成原儿茶酸浓度为91.6µg/ml 的对照品溶液次母液，精密吸取0.2 ml、0.5 ml、2.0 ml、4.0 ml、8.0 ml、10 ml 原儿茶酸对照品次母液，分别置于10 ml的容量瓶中，加入甲醇稀释定容至刻度，将稀释定容后的对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件测定并记录峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液浓度为横坐标（X，µg/ml），进行线性回归并绘制标准曲线。得到线性方程Y=72 437X-9 308.8（r=0.999 7），表 明原 儿茶 酸 浓度 在1.832～91.600µg/ml与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下的对照品溶液，按“2.1.1”色谱条件连续自动进样6 针，记录下峰面积并计算RSD 值。在精密度试验中，原儿茶酸对照品的平均峰面积为51 333 583，RSD 值为0.99%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 平行称取艾纳香药材粗粉（批号20180105）6 份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”色谱条件分别进样，记录峰面积并计算RSD 值。在重复性试验中，6 份样品原儿茶酸峰面积平均值为190 521，RSD=1.51%（n=6），原儿茶酸平均含量为0.056 mg/g，RSD=1.30%（n=6），表明此方法的重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 称取艾纳香药材粗粉适量（批号20180105）1 份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”色谱条件分别于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 进样，记录峰面积并计算含量及RSD值。在稳定性试验中，6 个时间点测定的平均含量为0.066 mg/g，RSD 为0.18%（n=6），表明待测样品溶液在24 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 精密称量重复性试验项下已测知含量的艾纳香药材粗粉6份，每份约50 g，按照药材原儿茶酸的含量，按照1∶1比例，加入一定量的原儿茶酸对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”色谱条件分别进样，记录峰面积并计算加样回收率。结果加样回收率的平均值为98.40%，RSD值为1.10%（n=6）。见表1。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）

2.2 单因素考察提取工艺

2.2.1 提取溶剂倍量的考察 称取一定量的药材粗粉于圆底烧瓶中，共8 份，分别加入8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水，浸泡90 min，回流提取60 min，过滤，取滤液2 ml 离心15 min（13 000 r/min），取上清液用0.22 µm 微孔滤膜滤过，续滤液用于测定原儿茶酸的含量。结果8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水对应的原儿茶酸的含量分别为0.033 mg/g、0.037 mg/g、0.041 mg/g、0.042 mg/g、0.044 mg/g、0.045 mg/g、0.049 mg/g、0.049 mg/g。表明随着加水倍量的增加，原儿茶酸的含量呈现上升的趋势，因此选取提取溶剂8、14、20倍量进行正交试验。

2.2.2 提取次数的考察 称取一定量的药材粗粉5份，置于圆底烧瓶中，分别加入20 倍量水浸泡90 min，分别回流提取1、2、3、4、5 次，每次60 min，过滤药渣，合并滤液。取滤液2 ml 离心15 min（13 000 r/min），将上清液用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液用于测定原儿茶酸的含量。结果回流提取1、2、3、4、5次得到的原儿茶酸含量分别为0.053 mg/g、0.092 mg/g、0.101 mg/g、0.106 mg/g、0.106 mg/g，因此选择提取1、2、3次为考察水平。

2.2.3 提取时间的考察 称取一定量的药材粗粉6份，分别加入20 倍量水浸泡90 min，分别回流提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，过滤，取滤液2 ml 离心15 min（13 000 r/min），将上清液用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液测定原儿茶酸的含量。结果得到的原儿茶酸含量分别为0.037 mg/g、0.038 mg/g、0.039 mg/g、0.044 mg/g、0.042 mg/g、0.042 mg/g。结合生产企业的时间效益和经济效益，因此选择提取30 min、60 min、90 min为考察水平。

2.3 正交设计优化提取工艺

2.3.1 因素水平 根据单因素考察结果，结合对大生产的环境、经济效益等实际情况的考虑，以原儿茶酸含量为评价指标，本实验选取加水倍量、提取时间、提取次数这3个对提取效果影响较大的因素进行正交试验设计，考察因素水平表见表2。

表2 因素水平表

2.3.2 正交试验 称取艾纳香药材粗粉约100 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，按表3正交试验方案安排进行试验，合并过滤液，摇匀。取药液2 ml，离心15 min（13 000 r/min），将上清液用0.22µm微孔滤膜滤过，按“2.1.1”色谱条件进样测定。正交试验方案安排及结果见表3，方差分析见表4、表5。

表3 正交试验方案安排与结果

表4 方差分析结果

表5 因素B与误差合并后的方差分析结果

由于因素B 与误差小，故可与误差合并。从表4和表5 结果可知，三个影响因素的大小为A＞C＞B，且A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，其中A、C 因素对提取的影响具有显著性意义，B1、B2与B3相差不大，因此，筛选出的最优提取工艺为A3B1C3，即在艾纳香药材中加20倍量水，提取3次，每次30 min。

2.4 验证试验 按优选出的最佳工艺对艾纳香进行提取3次，结果原儿茶酸含量高于正交试验中的结果，表明优选的工艺可行。见表6。

表6 提取工艺验证试验结果

3 讨 论

本实验在建立艾纳香提取液中原儿茶酸含量测定的方法中，进行了流动相的考察，比较了乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比例（8∶92和10∶90）的分离效果，根据分离度要求，最终选择了乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92）作为流动相；对流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）和进样量（5µl、10µl、15µl、20µl）也进行了考察，最终根据色谱峰的峰形及色谱峰峰面积，选择了流速为0.8 ml/min，进样量为15 µl；并参考相关文献［5-6］中的测定波长，选定为256 nm。所建立的HPLC 含量测定方法，线性关系良好，灵敏度高，具有简单、准确的特点，可作为艾纳香提取液的定量分析方法。

本研究在单因素基础上对艾纳香药材的提取工艺进行了正交设计优化，筛选出最优提取工艺，即在艾纳香药材中加20 倍量水，提取3 次，每次30 min。并对此工艺进行了验证，结果表明提取工艺稳定可靠、可行性好，可为艾纳香配方颗粒的制备提供参考依据。

（注：本文实验数据源自蔡雪梅在广西中医药大学攻读硕士的毕业论文）