多波长HPLC同时测定丹七粉中7个有效成分的含量

陈天山，黄慧学

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.桂林医学院，广西 桂林 541001）

丹七粉由丹七片改进而成，具有活血化瘀、通脉止痛的功效，用于瘀血闭阻所致的胸痹心痛、眩晕头痛、经期腹痛［1］。其处方由丹参和三七两味中药组成。丹参的化学成分包括水溶性和脂溶性两大部分，水溶性成分以丹酚酸B 含量最高；脂溶性的丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。三七的主要有效成分为三七总皂苷，其中以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1含量较高。《中华人民共和国药典》2015年版一部丹七片的质量标准中未收载丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮及丹酚酸B 的定量方法。为了更好地控制丹七粉的质量，笔者采用高效液相色谱法，对丹七粉中的隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹酚酸B 及三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进行含量测定，为建立丹七粉质量标准提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；MS105DU 型分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；YP-B5002 型电子天平（北京浩天晖科贸易有限公司）；JP-080S 型超声波清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；Milli-Q 超纯水器（美国Millipore公司）。

1.2 试剂与试药 丹参酮ⅡA对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：181011）；隐丹参酮对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110852-201808）；丹参酮Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110867-201609）；丹酚酸B 对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：181228）；三七皂苷R1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110745-201819）；人参皂苷Rg1对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-18080116）；人参皂苷Rb1对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-19012811）；乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水；丹七粉（自制10 批，批号：190601、190602、190603、190604、190605、190606、190607、190608、190609、190610）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水（8∶2）混合溶液50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-水（8∶2）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液的制备 分别取丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇-水（8∶2）混合溶液配成每1 ml 含丹酚酸B 200.0 µg、隐丹参酮10.0µg、丹参酮Ⅰ5.0µg、丹参酮ⅡA15.0µg、三七皂苷R140.0µg、人参皂苷Rg1200.0µg、人参皂苷Rb1100.0µg的对照品溶液，即得。

2.3 阴性溶液的制备 分别取缺丹参、三七的阴性样品，按2.1 项下的方法制成缺丹参和缺三七的阴性对照溶液，即得。

2.4 色谱条件 以Waters SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）为色谱柱；乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，洗脱程序见表1；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的检测波长为203 nm；隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的检测波长为270 nm；丹酚酸B的检测波长为286 nm。

表1 洗脱程序

2.5 线性关系考察 用自动进样器分别吸取每1 ml含丹酚酸B 2.04 mg、隐丹参酮0.12 mg、丹参酮Ⅰ0.06 mg、丹参酮ⅡA0.16 mg、三七皂苷R10.42 mg、人参皂苷Rg12.02 mg、人参皂苷Rb11.02 mg的对照品储备液0.5µl、1µl、3µl、5µl、10µl、20µl，按照2.4 项下的色谱条件测定，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得各对照品的回归方程及线性范围，结果见表2，表明7 种成分在各自线性范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10µl，注入液相色谱仪，按2.4 项下的色谱条件测定，记录色谱图。结果表明阴性溶液对丹七粉中主要有效成分的色谱峰无干扰，各对照品峰形良好（见表3、图1、图2、图3、图4）。

表2 线性关系考察

表3 专属性试验结果

图1 对照品图谱

图2 供试品图谱

图3 缺丹参的阴性对照图谱

图4 缺三七的阴性对照图谱

2.7 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 µl，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定并记录各主要有效成分的峰面积，计算RSD 分别为0.41%、1.22%、0.55%、0.97%、0.36%、0.89%、0.53%（均n=6），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批丹七粉（批号：190601）6 份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10µl 供试品溶液，注入液相色谱仪，分别测定供试品中各主要有效成分的含量，计算RSD 分别为0.93%、0.45%、0.39%、0.81%、0.62%、1.13%、0.78%（均n=6），表明该测定方法具有良好的重复性。

2.9 稳定性试验 取同一批丹七粉（批号：190601）6 份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10µl 供试品溶液，注入液相色谱仪，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样分析，测定并记录各主要有效成分的峰面积，计算RSD 分别为1.04%、0.54%、0.48%、0.72%、0.91%、1.01%、0.63%（均n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 加样回收试验 取丹七粉0.25 g（丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量分别为25.65 mg/g、0.91 mg/g、0.61 mg/g、1.52 mg/g、4.54 mg/g、22.59 mg/g、13.67 mg/g）6 份，精密称定，分别精密加入每1 ml 含丹酚酸B 2.04 mg、隐丹参酮0.12 mg、丹参酮Ⅰ0.06 mg、丹参酮ⅡA0.16 mg、三七皂苷R10.42 mg、人参皂苷Rg12.02 mg、人参皂苷Rb11.02 mg的对照品溶液3.0 ml，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.4 项下色谱条件测定，回收率见表4、表5，表明建立的丹七粉高效液相色谱检测方法准确度高。

2.11 样品含量测定 按照本试验建立的含量测定方法，测定10批丹七粉的有效成分含量，结果见表6。

3 讨 论

经查阅近年来丹七片的相关文献，尚未发现丹参酮类的含量测定及多波长HPLC同时测定丹七片中多种有效成分的研究报道，仅有采用HPLC 测定丹酚酸B 及三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的报道。其中丹酚酸B的提取方法多样：廖名爱等［2-4］采用50%乙醇超声处理30 min；夏明［5］先用稀盐酸酸化后再用乙酸乙酯萃取3 次；冯彬彬等［6］采用75%甲醇加热回流1 h。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的提取方法主要有：梁少强等［7-8］采用50%甲醇超声处理30 min；蔡向阳等［9］采用水饱和的正丁醇超声处理30 min。本实验参照《中华人民共和国药典》2015 年版一部收载的丹七片的标准，采用甲醇-水（8∶2）混合溶液超声处理30 min，取得了较好的提取效果。

表4 丹参有效成分的加样回收率试验结果 （n=6）

表5 三七有效成分的加样回收率试验结果 （n=6）

表6 10批丹七粉含量测定结果

文献［2-5］报道丹酚酸B 的HPLC 含量测定的色谱条件基本一致；流动相组成为甲醇-乙腈-甲酸-水，检测波长均为286 nm。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的分离方法主要有：梁少强等［7-8］以乙腈-水为流动相梯度洗脱分离；蔡向阳等［9］以乙腈-水-磷酸（20.5∶79.5∶0.02）为流动相进行分离；检测波长均为203 nm。金银芝［10］、应佳［11］测定丹七片中人参皂苷Rg1的含量，以甲醇-水为流动相，将检测波长设为280 nm。本实验参考文献［13］以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，各有效成分的检测波长与文献一致，取得了良好的分离效果。

丹七粉由丹七片改进而成，原剂型丹七片采用加水煎煮3 次的方式提取丹参的有效成分，由于丹参酮类为脂溶性成分，该提取方法导致丹参酮类有效成分转移率较低［13］。经剂型改进后，丹七粉中的丹参酮类有效成分转移率及含量得到了较大提高，需对该类有效成分进行定量监测；同时丹酚酸B 也是丹七粉发挥疗效的主要有效成分，因此本实验在《中华人民共和国药典》2015年版一部丹七片质量标准的基础上增加了丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量测定方法。本研究采用多波长HPLC同时测定丹七片中主要有效成分的含量，所建立的方法准确度高、重复性好，进一步提高了丹七粉的质量标准，为该制剂的质量控制提供了实验依据。