芪蛭丹通络胶囊的质量标准研究

张 文，黄春英，莫海涛，吴瀚翔，陆 勇，刘布鸣

（1.玉林市中医医院，广西 玉林 537000；2.广西子持医药科技有限公司，广西 南宁 530219）

芪蛭丹通络胶囊主要由黄芪、川芎、丹参、地龙、烫水蛭、石菖蒲、远志、粉葛组成，具有益气活血、化瘀通络、醒脑开窍的功效，用于中风恢复期和后遗症期之气虚血瘀证，症见半身不遂，言语不利，口眼㖞斜。芪蛭丹通络胶囊已获得广西医疗机构制剂生产批件（桂药制字Z20190003），为能更好地控制该制剂质量，本实验对其质量标准进行了研究，采用TLC 法对处方中黄芪、丹参进行定性鉴别，采用HPLC法测定粉葛中葛根素的含量，为制订芪蛭丹通络胶囊的质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC3000Ⅰ型高效液相色谱仪、UV3000紫外检测器（厂家：北京创新通恒科技有限公司）；CXTH-3000 色谱工作站（厂家：北京创新通恒科技有限公司）；Kromasil-C18柱（瑞典EKA Chemicals 公司）；KQ5200E 型超声波清洗仪（厂家：昆山市超声仪器有限公司）；HH-4电热恒温水浴锅（厂家：常州国华电器有限公司）。

1.2 试药 黄芪对照药材（批号：120974-200609）、丹参对照药材（批号：120923-201113）、葛根素对照品（批号：110752-200209），购于中国药品生物制品检定所和中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。芪蛭丹通络胶囊由广西子持医药科技有限公司和玉林市中医医院制剂室提供，批号：170914、170915、170916、171023、171024、171025。

2 薄层色谱鉴别

2.1 黄芪的TLC鉴别 取本品内容物3 g，加甲醇20 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 ml 使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH 值到5～6，用乙酸乙酯振摇提取2 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，用水振摇提取2次，每次20 ml，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1 ml 使溶解，作为供试品溶液。取黄芪对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。另取缼黄芪阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502）［1］试验，吸取上述3 种溶液各3～5 µl，分别点于同一硅胶G 薄层板，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（254 nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（Rf 值0.50）。阴性无干扰（见图1）。

2.2 丹参的TLC 鉴别 取本品内容物3 g，加75%乙醇20 ml，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml 使溶解，作为供试品溶液。取丹参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取缼丹参阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则0502）［1］试验，吸取上述3 种溶液各3～5µl，分别点于同一硅胶G 薄层板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的香草醛硫酸试液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（Rf值0.52）。阴性无干扰（见图2）。

图1 芪蛭丹通络胶囊中黄芪薄层色谱图

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；检测波长为250 nm；流动相为甲醇-水（24∶76）；流速为1.0 ml/min；柱温为室温。理论塔板数按葛根素峰计应不低于4 000。

3.2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1 ml含20µg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.4 g，精密称定，置25 ml 量瓶中，加30%乙醇20 ml，超声处理30 min，冷却至室温，加30%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备 按芪蛭丹通络胶囊处方和方法制备缺粉葛的阴性样品，取约0.4 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备缺粉葛阴性对照溶液。

图2 芪蛭丹通络胶囊中丹参薄层色谱图

3.5 标准曲线及线性范围考察 精密称取葛根素对照品10.1 mg，置25 ml 量瓶中，用30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成404 µg/ml 对照品溶液，备用。分别精密吸取上述对照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀，分别进样测定。0.5 ml 的稀释液进样2.5 µl、5 µl、10µl，其余浓度的稀释液进样10µl，测定，以葛根素对照品进样浓度（µg/ml）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归曲线为Y=41 669X-5 721.4，相关系数r2=1。结果表明：葛根素进样浓度在5.05～161.60µg/ml 之间与峰面积积分值呈线性关系。

3.6 精密度试验 分别精密吸取葛根素对照品溶液（20.2µg/ml）和供试品溶液（批号171024）各10µl，连续进样6 次，依次测定峰面积值，结果对照品RSD 为0.82%（n=6），供试品RSD为1.27%（n=6）。

3.7 重复性试验 精密量取同一批号供试品（批号171024）共6 份，按供试品制备项下方法进行制备，测定。结果测得葛根素含量为1.13 mg/g，RSD=1.38%（n=6）。表明该方法重复性良好。

3.8 稳定性试验 取供试品溶液（批号171024），每隔2 h（0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h）分别进样10µl，测定峰面积值。结果供试品的峰面积值RSD 为1.27%（n=6），表明供试品溶液在10 h内保持稳定。

3.9 加样回收率试验 精密量取已测知含量的同一批供试品（批号171024）0.2 g（含量为1.13 mg/g）6 份，加入404µg/ml 葛根素对照品溶液0.6 ml，按供试品制备项下方法进行制备，测定。结果葛根素平均回收率为98.8%，RSD为0.93%（n=6），结果见表1。

表1 加样回收试验结果 （n=6）

（续表1）

3.10 样品测定 按供试品的制备及检测方法，测定6批芪蛭丹通络胶囊中葛根素的含量，结果见表2。葛根素含量在1.105～1.258 mg/g之间。

表2 样品中葛根素含量测定结果 （n=2）

图3 HPLC色谱图

4 讨 论

芪蛭丹通络胶囊由黄芪、川芎、丹参、地龙、烫水蛭、石菖蒲、远志、粉葛等组成，本研究采用TLC 法对处方中黄芪、丹参进行定性鉴别，采用HPLC法测定粉葛中葛根素的含量，分析方法精密度高，准确度、重复性均较好，并且操作简便、快捷。

在薄层色谱研究中，本实验曾对方中川芎、烫水蛭、远志进行了薄层色谱鉴别，结果供试品色谱中，在与川芎和烫水蛭对照药材色谱相应的位置上，无相同颜色的斑点，故未收入标准正文；在与远志对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的斑点，但由于未购得中国食品药品检定研究院的远志对照药材，故也未收入标准正文。黄芪、丹参的薄层色谱鉴别结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰，重现性好，阴性无干扰。

粉葛具有清香、升阳之功，还能醒脑开窍［2］，其指标性成分葛根素可通过抗交感样作用、钙拮抗作用及广泛的β 受体阻滞作用，发挥扩张血管、降血糖、血脂、抗氧化的功效［3］。目前葛根素研究得比较透彻，含量测定方法较成熟，因此本研究将其作为本品质量控制的指标之一，采用HPLC 法测定粉葛中葛根素的含量。在供试品溶液的制备中，本试验对提取方法、提取溶剂、溶剂用量、提取时间进行了单因素考察：①采取超声30 min、加热回流1 h、索氏提取2 h进行提取方法的考察，结果三者提取得到的葛根素含量相差不大，但超声提取更简便、快捷，故采用超声提取法；②采用甲醇、30%乙醇、乙醇进行提取溶剂的考察，结果30%乙醇提取所得含量最高，故采用30%乙醇作为提取溶剂；③以10 ml、25 ml、50 ml 进行提取溶剂用量的考察，结果10 ml 提取所得含量最低，25 ml 与50 ml 提取所得含量相差不大，从节省溶剂考虑，故提取溶剂量定为25 ml；④以超声处理15 min、30 min、60 min 进行提取时间的考察，结果15 min 提取所得含量最低，30 min 和60 min 提取所得结果无明显差别，故提取时间定为30 min。在色谱条件摸索中，经对葛根素紫外最大吸收波长进行扫描，其紫外最大吸收波长为250.50 nm，故最后选定检测波长为250 nm；以甲醇-水为流动相，考察了不同比例，最后确定甲醇-水（24∶76）的比例较为适合。