柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

汪颖楠，依鸣，徐维祯，钟照华

哈尔滨医科大学微生物学教研室， 哈尔滨 150081

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B，CVB)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属成员，基因组为长7.4 kb的单股正链RNA(+ssRNA)[1]，编码一个大分子前体蛋白，被自身编码的蛋白酶2APro、3CPro逐级切割，最终形成4个结构蛋白(VP1～VP4)和7个功能蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[2-4]，其中，3D是病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，为病毒复制的关键酶[5-6]。

CVB在复制传代过程中存在基因组不稳定现象。研究显示，在感染小鼠心脏组织中发现了5′端7～49个碱基缺失的CVB3基因组RNA，并证明缺失RNA与全长基因组的混合物可在宿主体内复制并持续存在[7]。本课题组前期的研究也显示，插入外源增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)基因的CVB3-eGFP重组毒株在感染细胞后，病毒基因组RNA出现剪切和拼接[8]。由此推测CVB感染可能会产生不完整的基因组剪切片段，但目前尚无实验证据证明，因此CVB基因组剪切的序列特点和机制均不清楚。

cDNA末端快速扩增技术是基于聚合酶链反应(PCR)原理的cDNA末端片段扩增方法[9]，可用于cDNA的3′和5′端扩增，其中5′ cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE, 5′ RACE)以cDNA为模板，利用3′端已知序列为引物，扩增获得第1条链后，在其5′端添加人工接头，以人工接头序列为5′引物，完成PCR扩增。本研究利用5′ RACE，从CVB感染细胞中扩增和克隆病毒基因组3′端片段，分析CVB基因组剪切序列的特点，为进一步研究CVB基因组的剪切和生物学意义提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa细胞、CVB3 Woodruff毒株、3D抗体来自哈尔滨医科大学微生物学教研室。内参GAPDH抗体购于美国Proteintech公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于万类生物科技有限公司，CVB全基因cDNA克隆质粒pMKS1由J. Linsay Whitton教授(美国Scripps Research Institute)惠赠。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq聚合酶、SMARTer RACE 5′/3′试剂盒、凝胶回收试剂盒与In-Fusion HD Cloning Kit购于日本TaKaRa公司，TRIzol和质粒提取试剂盒购自美国赛默飞公司，10% PAGE凝胶试剂盒购于美国EpiZyme公司，CDP-Star显色液购自哈尔滨欣科瑞有限公司，探针及引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成，测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计5′ RACE扩增的上游引物为通用引物，序列为5′-CTAATACGACTCACTATA-GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。为获得编码区完整的剪切片段，依据CVB3基因组3′非翻译区(untranslated regions，UTR)序列，经Gene Runner软件设计下游特异性引物。为便于后续In-fusion克隆，下游引物5′ 端引入特定碱基序列GATTACGCCAAGCTT。下游引物序列：5′-GATTACGCCAAGCTTTGCACCGTTGTCTAG-TTCGGTTAGTACAGTAGGGTTAAGCCAAT-3′。

1.2.2 感染细胞总RNA的提取将HeLa细胞接种于6孔板内(1×106/孔)，37 ℃、 5% CO2常规培养24 h；当细胞生长融合度为80%～90%时，更换新鲜完全培养液；实验孔加2 μL CVB3液(TCID50= 10-4.75/0.1 mL)；孵育1 h后，换新鲜细胞培养液继续培养；24 h后收取细胞沉淀。参照TRIzol说明书操作提取感染细胞总RNA。收集的感染细胞沉淀物中加入TRIzol试剂并混匀，加入氯仿进行相分离，取水相加入异丙醇沉淀RNA，经75%乙醇洗涤沉淀物，用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解获得总RNA。

1.2.3 通过5′ RACE及In-fusion克隆获取剪切片段序列RNA与通用引物混合，72 ℃孵育3 min，42 ℃冷却2 min，14 000×g离心10 s。加入DTT、dNTPs、SMARTer Ⅱ A寡核苷酸及反转录酶混匀，42 ℃孵育90 min，70 ℃加热10 min。加入10 mL Tricine-EDTA缓冲液稀释cDNA产物。以cDNA为模板，进行5′ RACE扩增。反应条件：94 ℃ 变性30 s，68 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸3 min，共25个循环。凝胶电泳回收扩增产物，回收产物经In-fusion连接酶与线性化pUC19载体50 ℃孵育15 min；连接产物转化大肠埃希菌Stellar感受态细胞后涂布于Amp+LB固体培养基平板，37 ℃倒置过夜培养；随机挑取单克隆菌落，接种于Amp+LB液体培养基中，37 ℃过夜培养；提取质粒，以pUC19质粒为对照筛选的阳性克隆，送北京睿博兴科公司测序，测序引物为通用引物M13F及M13R。

1.2.4 Northern印迹(Northern blot)杂交实验HeLa细胞感染病毒后分别于0、12、24 h收获细胞，提取RNA，用1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶分离，变性RNA转印至阳性尼龙膜，固定后预杂交，再加入地高辛标记的探针杂交过夜，探针为DIG-UTP标记的病毒3D编码区一段200个核苷酸的片段。用含有0.1% 十二烷基硫酸钠的0.1×枸橼酸钠盐水(saline-sodium citrate，SSC)洗膜，封闭液常温封闭1 h，加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体0.5 μL，常温孵育1 h，洗膜，加CDP-Star显色液显色。

1.2.5 实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法收取CVB3感染24 h的HeLa细胞并提取RNA和蛋白，使用实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)法对CVB3的表达进行检测。根据PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书，依据CVB3基因组5′ UTR设计并合成特异性引物，以GAPDH基因作为内参进行RT-qPCR检测，用2-ΔΔCt方法分析结果。Western印迹法检测蛋白：准备10% PAGE凝胶，以每孔25 μL蛋白量上样，预染蛋白相对分子质量标准上样量为10 μL。实验条件：120 V恒压电泳2 h；300 mA恒流转膜60 min；室温置封闭液中2 h；将膜置于1∶3 000稀释的3D抗体及GAPDH抗体中，室温孵育2 h；用含吐温20的Tris-HCl缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗3次；室温孵育辣根过氧化物酶标记的兔二抗2 h；TBST洗5次；显色并记录结果。

1.2.6 基因序列分析及二级结构预测基因测序结果经BLAST、ApE 及DNAMAN软件比对分析并绘制模式图。二级结构预测由RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在线完成。

2 结果

2.1 CVB3基因组存在基因剪切片段

HeLa细胞接种于6孔板，细胞密度为80%～90%时用CVB3液感染，24 h后收取细胞沉淀物，分别提取感染细胞总蛋白和总RNA。Western印迹检测到病毒3D蛋白条带，相对分子质量约为 58 000(图1A)；RT-qPCR显示，CVB3 RNA高表达(P<0.01)，差异有统计学意义(图1B)；Northern印迹检测显示，在病毒感染后12、24 h，CVB3的基因组中出现剪切片段并且有固定的条带分布，非随机剪切的产物(图1C)。

A: Western blot for 3D protein in the HeLa cells infected with CVB3 for 24 h. B: RT-qPCR for CVB3 RNA in the HeLa cells infected with CVB3 at 24 h. *: P<0.01, unpaired t test. C: Northern blot for CVB3 genomic RNA in the HeLa cells infected with CVB3 for 0，12，24 h.

2.2 获得CVB3基因组剪切片段及基因序列

感染细胞总RNA通过去RNA酶反应和连接5′ RACE接头序列后，反转录得到cDNA 模板，PCR扩增后进行凝胶电泳。结果显示，2 500～7 500 bp区域可见大小不同的多条扩增产物条带(图2A)。依据课题组前期预测，回收2.0与7.5 kb之间所有的目的基因片段。

凝胶电泳回收目的基因片段，连接于pUC19线性载体，随机挑取单克隆鉴定，对筛选出的20个阳性克隆进行测序。这些RNA片段长度在 2 067～5 547 bp之间，与预期相符。BLAST和DNAMAN分析显示，所获得的片段为病毒基因组的3′片段。与完整病毒基因组相比，缺少长约793～5 144 bp的5′端序列。其中有5个片段的断端位于CVB3基因组的2Apro编码区，6个片段的断端位于CVB3基因组的2C编码区(图2B)。除5′端基因缺失外，部分片段还出现序列丢失和拼接现象。如图2B所示，20条片段基因序列中，有11条片段是CVB3基因组某一段的连续性基因片段，另9条为CVB3基因组非连续的拼接片段。

A: The gel electrophoresis of the 5′ RACE product, recover fragments ranging from 2.0～7.5 kb and cloned into pUC19. M1: DL15000 marker; 1: CVB genomic fragments; M2: wide-range 10 000 molecular weight marker. B: The position of the spliced fragments correspond the CVB3 full-length genome, and the number of start and stop bases.

2.3 CVB3基因组剪切片段断端基因序列二级结构的预测

以CVB3基因组为参照，分别选取20条片段的断端位点上下游各100 bp碱基，应用RNAfold预测其二级结构。结果显示，有9条剪切片段的断端序列位于发卡结构上(图3A)，有8条位于发卡结构附近或内环结构上(图3B)，还有3条剪切片段断端序列未形成特殊的二级结构(图3C)。

The secondary structure was predicted by selecting 100 bp around the starting position of the CVB genomic fragments (the position of the site was circled in red). A: The breakpoint sequence is located on the hairpin loop. B: The breakpoint sequence is near the hairpin structure or located on interior loop. C: No special structure.

3 讨论

CVB是人类病毒性心肌炎的主要病原体，可造成严重的心肌损伤及纤维化，为不可逆的扩张型心肌病的致病原因之一。CVB基因组的5′ UTR含有特殊的二级结构，介导病毒RNA与宿主核糖体结合，启动病毒蛋白翻译[10-11]。研究发现[12-13]，在扩张型心肌病患者心脏组织中，CVB3基因组部分5′ UTR有多个碱基缺失，可能与其持续感染相关。本课题组的前期研究推测CVB基因组在感染细胞过程中存在不稳定现象[8]。

本研究通过Northern印迹实验结果发现，CVB3在感染细胞过程中可产生大量不完整的病毒RNA片段，5′ RACE扩增实验进一步证实了病毒基因组断裂片段的序列特点，支持此前关于CVB在细胞中存在病毒基因组不稳定现象的推测。

从获取的20条CVB3基因组片段分析可见，断裂片段的5′端起点不是随机分布，而是主要集中在2Apro和2C编码区。断裂片段中有11条为连续性序列，9条为非连续性拼接片段，提示断裂片段在细胞中经过了RNA编辑。因此，病毒基因组断裂并非是提取核酸时机械性破坏造成的结果。

RNA剪接是真核细胞mRNA成熟过程中重要的一环，这个剪切和拼接机制也能用于病毒基因组RNA[14]。有报道称，甲型流感病毒复制过程中可使用剪接的mRNA增加病毒复制所需相关蛋白的数量[15-16]； 人类免疫缺陷病毒基因组的转录本通过最佳剪接过程可产生40多种mRNA，用于产生前体蛋白或其他调节基因的单剪接mRNA[17]。研究表明， 宿主细胞中的Dicer、AGO2等RNA酶可识别病毒基因组特定序列或特定的茎-环结构，产生小片段RNA并形成沉默复合物，靶向作用病毒RNA并降解[18-19]。本研究检测到的是CVB3基因组来源的长片段，对这些片段5′断点附近序列进行二级结构预测，结果提示多数断端位点可形成茎-环结构，局部形成双链RNA，可能成为Dicer、AGO2等细胞RNA酶的靶序列。断裂片段的产生机制有待后续实验阐明。

病毒基因组还可被剪切产生有功能的小片段[20-21]，如Dicer可切割肠道病毒71型5′端序列，产生病毒源性小RNA(virus-derived small RNA，vsRNA)，并可反向作用于病毒基因组，干扰病毒复制。本研究发现的CVB3基因组RNA断裂片段也可能被进一步剪切，形成有生物学活性的小片段。本课题组另一项研究显示，在CVB3感染的细胞中存在大量vsRNA，而且部分vsRNA可发挥miRNA样作用，影响病毒复制(结果另文发表)。

本研究是一项初步探索性工作，仅以HeLa细胞为例，并且在简化感染条件下观察CVB基因组的不稳定性，结果证实了我们的推测。CVB在感染细胞(尤其是心肌细胞)的过程中，病毒基因组的稳定性如何变化需要进一步实验观察。本研究的发现为进一步研究CVB基因组的剪切和生物学意义提供了实验依据。