从新型冠状病毒疫情看生物安全三级实验室的应急能力及内涵建设

蔡霞，韩文东，孙志平，钱韵，陈力，谢幼华，瞿涤,

1. 复旦大学生物安全三级实验室, 上海 200032; 2. 复旦大学上海医学院基础医学院教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室, 上海 200032

2019年12月以来多个国家陆续出现了新型冠状病毒感染的肺炎疫情，我国将此类病例纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理[1]。2020年1月30日世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布这次新型冠状病毒疫情为国际关注的突发公共卫生事件[2]。2020年2月11日，国际病毒分类委员会宣布将此新病毒命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”；WHO宣布这一新疾病的名称为“2019冠状病毒病” (corona virus disease 2019，COVID-19)[3]。2020年3月12日WHO再次宣布COVID-19为全球大流行病(pandemic)[4]。在疫情防控中，实验室在患者的病原诊断以及有关药物和疫苗的研发中发挥着不可忽视的作用。为了保证实验室的生物安全，国家卫生健康委员会(简称卫健委)发布了《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》(简称《指南》)[5]，将新型冠状病毒暂时按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理。《指南》明确指出：病毒培养、动物感染实验等操作应当在生物安全三级(biosafety level 3,BSL-3)实验室内进行；未经培养的感染性材料的操作以及临床样本的灭活等操作应当在BSL-2实验室进行，同时采用BSL-3实验室的个人防护[5]。面对此次突发的SARS-CoV-2感染疫情，及时、安全地启动并稳定运行BSL-3实验室，为科研攻关提供安全、可靠的技术平台，是对实验室应急能力的考验。在此, 将复旦大学BSL-3实验室紧急启动并保障新冠病毒研究安全进行的体会总结如下。

1 复旦大学BSL-3实验室紧急启动和日常运行

复旦大学BSL-3实验室于2020年1月24日(除夕)接到上海市卫健委及复旦大学下达的任务后紧急启动。在短暂的3 d内准备好申报新型冠状病毒实验(包括风险评估及相关实验操作程序等)的资料。资料经复旦大学生物安全专家委员会审核并经校生物安全委员会主任(校长)批准，由上海市卫健委上报国家卫健委。 实验室于1月28日和 30日先后获得中国合格评定国家认可委员会 (China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)和国家卫健委批准进行新型冠状病毒实验；同时对新型冠状病毒研究攻关成员进行强化培训，为及时从来自上海的患者样本中分离病毒提供了实验平台。在此次实验室应急启动中，复旦大学BSL-3实验室充分体现了“战时一分钟，战前十年功”的精神。

1.1 复旦大学BSL-3实验室的建设背景及日常运行

复旦大学BSL-3实验室是上海市及复旦大学的高致病性微生物研究平台，其作用定位于科研和教育。2002年在闻玉梅院士的建议下，复旦大学BSL-3实验室作为复旦大学“211”重点学科建设项目立项。2008年9月复旦大学BSL-3实验室通过CNAS生物安全实验室评审，并获得卫生部(现国家卫健委)批准的实验活动资格，可进行包括结核分枝杆菌、人类免疫缺陷病毒、甲型流感病毒(H1N1)、中东呼吸综合征冠状病毒、高致病性禽流感病毒、布鲁菌属等病原的操作及动物感染实验。实验室的3个核心区经常同时开放，3～4个项目组进入，故而生物安全管理面临很大的挑战。依据我国的法律、法规及上海市相关规定，结合自身特点，复旦大学BSL-3实验室建立了BSL-3实验室生物安全管理体系，加强了BSL-3实验室内涵建设。通过十多年的安全运行，特别是在进行呼吸道传播病原〔如高致病性禽流感病毒(H7N9)、结核分枝杆菌〕实验项目的管理中，积累了丰富的实际工作经验(每年开机时间见图1)，为迅速开展SARS-CoV-2实验奠定了坚实的基础。

1.2 BSL-3实验室应急状态下必须依法管理

本次疫情中，复旦大学BSL-3实验室在短暂的数天内能获得资质并开展SARS-CoV-2攻关实验，也是基于我们对法律、法规以及申请流程的熟悉。我国对BSL-3实验室及其实验活动施行严格的管理制度，合法、合规地开展实验是实验室安全运行的基础。即使在紧急状态下开展的实验也必须符合国家及地方的法律、法规。我国对BSL-3实验室的管理有“规定多，要求严，变化快”的特点，只有“平时”熟悉各种法律、法规，才能在“战时”(紧急状态)不踩法律红线，确保各项实验在法律规定范围内进行。目前，《中华人民共和国传染病防治法》是我国进行生物安全实验室管理的主法。根据《中华人民共和国传染病防治法》，国务院出台了《病原微生物实验室生物安全管理条例》(国务院424号令)等相关行政法规，各部委也相继出台了多部规章以规范实验室的各项活动。同时，各地根据自身的特点制定了地方性法规。此外，CNAS等机构还制定了各种国家标准、行业标准。复旦大学BSL-3实验室平时注重与国家及上海市有关主管部门的沟通和联系，加强与中国疾病预防控制中心的业务合作，及时咨询并获得新的信息。同时定期组织实验室人员学习相关法律、法规，熟悉国家及地方关于实验室管理的各项规定和准则，及时关注新发布的各项规范并内化为实验室日常管理制度或程序，确保在应急状态下能合法、合规地开展活动。

注：根据国标GB19489-2008要求，2011年对BSL-3实验室进行转换整改，因此当年开机时间较短。

2 BSL-3实验室在疫情中的快速应答与内涵建设

在接到任务后，复旦大学BSL-3实验室于2020年1月24日紧急启动申报开展新型冠状病毒实验的资格流程；1月25日检查实验室设施设备运行的安全性；同时对攻关组成员进行新型冠状病毒风险评估，以及生物安全、个人防护装备佩戴和穿脱、污染废物处置等方面的强化培训。1月30日实验室获得了开展新型冠状病毒实验的资格，攻关组于2月7日从来自上海患者的样本中分离到COVID-19病毒株[6]。BSL-3实验室在疫情中的快速应答体现了实验室平时软实力(即内涵)的建设，包括实验室日常管理、人员培训管理以及实验技术储备等。复旦大学BSL-3实验室根据自身特点，对实验室的所有活动制订了切实可行的、系统的体系文件，涉及组织机构和人员管理、文件与档案管理、微生物危害评估、样品和菌(毒)种管理、病原微生物安全操作等内容。同时，根据平时的实验活动，实验室还制订了相应的制度和操作程序，并根据具体情况的改变及时修订文件，以保证实验室各项活动有条不紊地进行，并在应急时顺利开展各项实验。

2.1 BSL-3实验室的设立单位建立完善的管理体系

复旦大学BSL-3实验室的设立单位是复旦大学，并由复旦大学下拨经费支持。为保证实验室的正常运行并在紧急时刻能及时启动，复旦大学建立了一套包括校长、书记及各相关职能部门在内的管理体系。针对此次疫情，复旦大学立即成立了新型冠状病毒攻关领导小组，校长授权领导小组组长进行管理。在领导小组下成立了新型冠状病毒项目管理组、攻关组、平台组(BSL-3实验室)以及专家组，并制订了新型冠状病毒项目管理流程(图2)和相关实验申请流程(图3)，项目管理的原则是“生物安全一票否决制”。

图3 复旦大学BSL-3实验室开展新型冠状病毒实验的申请流程

图2 复旦大学新型冠状病毒项目管理流程

复旦大学BSL-3实验室的管理实行校长领导下的生物安全管理委员会负责制，并由多个职能部门配合。实验室同时接受来自CNAS、国家卫健委等上级主管部门和上海市相关部门的监督和管理、业务指导和技术支持。复旦大学建立了以闻玉梅院士为主任的生物安全专家委员会，负责为所涉及高致病性病原微生物的研究工作提供技术咨询及审核，以保障实验室能安全进行相关研究。此次疫情中，生物安全专家委员会为新型冠状病毒研究工作的方案、操作程序进行生物安全审查并提供技术咨询，保障了实验安全、平稳、高效地进行。

2.2 BSL-3实验室风险评估和管理

风险评估是实验室生物安全管理的核心[7]。

SARS-CoV-2为新现病原体，在疫情发展初期，其传播途径、存活能力等特性并不确定，开展实验存在较大的潜在风险，因此对SARS-CoV-2实验的风险评估和管理对于实验室风险管控至关重要。由于本室长期开展经呼吸道传播的高致病性禽流感病毒H7N9等实验项目，在进行H7N9相关的实验中积累了经验，从而为此次SARS-CoV-2实验风险点的识别及风险控制措施的制订奠定了良好的基础。

《病原微生物实验室生物安全通用准则》(WS 233-2017)指出：“实验室应建立并维持风险评估和风险控制制度，应明确实验室持续进行风险识别、风险评估和风险控制的具体要求”[8]。复旦大学BSL-3实验室根据从事的高致病性病原微生物特点及操作过程中可能产生的生物危害，建立了一套实验室生物危害风险评估的管理体系，从而为此次顺利开展SARS-CoV-2的研究工作夯实了基础。实验风险评估由实验室主任和生物安全负责人组织，实验室生物安全委员会委员、相关专家及工作人员参加。风险评估的内容包括实验可能涉及的所有环节，如：实验涉及的致病性生物因子的特性、操作过程、安全管理的风险、操作人员的风险、实验室设施和设备等。由于病原微生物信息不断更新以及生物安全实验室的变更等因素，风险评估是一种动态发展的工作，需及时更新。风险评估进行更新时，由复旦大学生物安全委员会指派实验室生物安全负责人组织。生物安全负责人收集相关致病性病原微生物危害程度的最新资料，同时组织专家对疑难问题进行讨论。

2.3 SARS-CoV-2的风险评估及管理

COVID-19疫情发生后，本实验室在启动紧急申报任务的同时，立即组织人员(包括攻关组成员)对SARS-CoV-2相关的实验进行风险评估。SARS-CoV-2主要通过飞沫或与感染者密切接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能[1, 9]。根据SARS-CoV-2的这一传播特性，实验人员在进行相关实验时加强了呼吸道及黏膜的个人防护，按要求佩戴N95口罩以及正压通气面罩或护目镜。并且根据具体情况，在实验中对关键环节的风险进行再评估。在此次SARS-CoV-2相关实验过程中，发现该病毒的感染剂量较低，因此实验人员在扩增病毒时应加强个人防护并提高防护意识。根据这一情况，实验室重新修订了针对SARS-CoV-2的个人防护标准作业程序(Standard Operating Procedure，SOP)，并对实验人员进行了再培训，以控制风险。

与H7N9病毒不同，SARS-CoV-2对下呼吸道损害严重，其细胞表面受体为血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)。ACE2在人肺泡上皮细胞和小肠上皮细胞中表达最为丰富，并在器官的动脉和静脉内皮细胞及动脉平滑肌细胞中表达[10]，表明该病毒不仅较易引起人体感染，同时可能感染多个细胞系(部分表达ACE2的细胞见表1)。因此，在进行SARS-CoV-2相关实验时，强调不仅需要加强实验人员的个人防护，同时还要特别关注所使用的细胞系。实验过程中使用的细胞系必须为无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级，禁止使用可能含有其他病原体的细胞系，以防止不同病毒发生重组。

表1 部分表达ACE2的细胞

2.4 应急状态下BSL-3实验室的管理

BSL-3实验室在疫情应急状态下的有效管理是基于实验室的日常管理。只有日常管理到位，才能在应急时安全、高效、有序地开展实验。在涉及SARS-CoV-2的研究中，攻关组和平台组双方指定生物安全负责人，及时沟通实验及实验中出现的状况，并解决问题，在保证实验室和人员安全的情况下推动实验的顺利进行。实验室也对各种紧急情况制订应急预案、组织模拟演练并及时总结和优化。同时，建立关键岗位人员替代制度，在指定人员无法及时到位的情况下，替代人员需及时补位。此次COVID-19疫情发生时，正值春节期间，在部分实验室工作人员无法及时到位的情况下，替代人员迅速补位，保证了SARS-CoV-2相关实验的顺利开展。

2.5 应急状态下BSL-3实验室人员的培训及管理

人是实验室生物安全管理的第一要素。根据国家规定，BSL-3实验室的工作人员需经过CNAS及卫生主管部门现场评审专家组及相关主管部门的考核并备案方可进入实验室工作[13]。

2.5.1 SARS-CoV-2实验人员的培训为了降低实验室感染的潜在风险[14]，需及时、定期开展实验人员生物安全培训，以保证项目的顺利进行。复旦大学BSL-3实验室是复旦大学的高致病性病原微生物研究平台，有不同项目组的人员进入实验室进行操作，因此实验室平时需要对不同背景的项目组人员进行有针对性的相关专业知识及技术培训，及时更新培训内容，针对薄弱环节开展多种形式的反复培训与演练，项目组人员只有通过实验室的培训及考核后方可进行实验。对于获得上岗证的项目组，实验室指定BSL-3生物安全负责人对项目组进行定期或不定期的监督，以便及时发现问题，指导其对所存在问题进行风险分析并整改，禁止不符合要求的实验人员进入实验室开展实验。COVID-19疫情发生后，国家卫健委、CNAS等针对新现病原及时发布各项规定、指南等文件，中国疾病预防控制中心的专业部门也发布各种关于新现病原的病原学、防控措施等信息。BSL-3实验室及时收集此类信息并制订相应的操作方案，开展风险评估，组织项目组实验操作人员进行相关知识的培训，包括对于新现病原的各种防护及实验技术操作培训；同时对项目组人员进行理论及操作考核，考核通过后方可进行涉及SARS-CoV-2的实验。在相关实验过程中，BSL-3实验室工作人员对实验人员进行监督，及时发现和纠正问题。当发现存在比较大的风险隐患时，召开项目组人员与BSL-3实验室人员联席会议，提出实际可行的、有针对性的解决方案。

2.5.2 新型冠状病毒攻关组的管理本次COVID-19疫情中，参与SARS-CoV-2相关实验的项目组成员由复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室和病原生物学系不同课题组的骨干人员临时组成。在项目组中不同课题组成员间开展协调工作是对本实验室应急管理能力的考验，顺利通过考验离不开实验室平时在项目组管理中的经验积累。不同于疾病预防控制中心系统的BSL-3实验室，复旦大学BSL-3实验室平时的实验以科研与教学为主，对来自不同单位的项目组开放，有不同的研究人员进入。每年有 6～7个项目组进入BSL-3实验室开展实验(包括人类免疫缺陷病毒的细胞感染实验以及结核分枝杆菌、高致病性禽流感病毒H7N9、布鲁菌的细胞及动物感染实验)。由于项目组人员的背景不同，因此需要对项目组进行管理。本次SARS-CoV-2的实验主要以复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室为主的SARS-CoV-2攻关组负责，我们平时积累的项目组管理流程和经验发挥了作用，保证了实验的顺利进行。

2.5.3 BSL-3后勤保障人员的培训及管理复旦大学BSL-3实验室日常运行需要后勤保障人员对实验室进行维护。后勤保障人员(包括维护公司的人员)未经允许不能进入BSL-3实验室核心区。经过许可进入指定的实验室核心区的后勤保障人员必须熟悉实验室的安全操作规程及最新的生物安全防护知识，了解进入实验室核心区的潜在危险，经过培训取得上岗证后在BSL-3实验室工作人员的陪同下方可进入核心区。在COVID-19疫情暴发时，由于后勤保障人员平时对实验室核心区非常了解，可以尽快进入实验室进行系统调试，为开展SARS-CoV-2的相关实验争取了宝贵的时间。

2.6 BSL-3实验室针对SARS-CoV-2的实验技术储备

实验技术的积累是BSL-3实验室顺利、高效开展实验的技术保障。在高等级生物安全实验室的日常运转中，工作人员需具备完备的专业知识和良好的操作技能，特别是科研人员须拥有精湛的微生物实验操作技术，方可降低发生生物安全事故的可能性[15]。只有了解相关病原的操作，才能识别关键风险环节，制定可行的风险控制措施。因此，BSL-3实验室人员应了解和熟悉在本实验室开展的相关病原微生物实验操作及流程。复旦大学BSL-3实验室人员在负责实验室安全运行管理的同时，经常向项目组人员学习并进行交流。复旦大学BSL-3实验室与基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室和病原生物学系已建立密切的合作关系，即BSL-3实验室为重点实验室提供高致病性病原微生物研究平台，重点实验室为BSL-3实验室提供技术支持。在此次COVID-19疫情中，双方的优势得以充分发挥，使得项目组能够快速从患者样本中分离到SARS-CoV-2毒株，并形成了规范操作程序等文件。BSL-3实验室团队与攻关团队在实践中互相学习，共同提高。

2.7 BSL-3实验室设施和设备的保障

2.7.1 BSL-3实验室设施设备运行的管理本实验室在紧急情况下能够平稳启动并安全地开展实验，软实力是保障，而硬件是基础。本次疫情发生时，正值实验室停机检修阶段(包括对实验室维护结构的严密性检测，实验室防护区的换气次数检测，压力、温度、湿度传感器校准，送风高效过滤器更换等)，能够在短时间内完成检修并紧急启动，离不开平时长时间运行中的经验积累(实验室设施、设备的安全运行对于实验室的安全运行非常重要，具体经验将另文介绍。)

2.7.2 实验室设施系统维护与应急响应复旦大学BSL-3实验室系统的运行与管理分为3个层级，包括日常运行管理、维护保养(周、月、季和年)管理以及年度检测。设施系统的维护、维修委托维保公司进行，实验室的设施负责人进行监督、检查。维护方案由实验室与维保公司共同制订。系统出现问题时，维保公司人员必须在2 h内到达现场进行维修。同时，实验室生物安全设施系统须按规定通过第三方检测机构的年度检测[16]。实验室日常的及时维护和检测可保障实验室在疫情发生时紧急启动并平稳运行。此次紧急启动中，维保公司在正月初一即派员到位启动实验室并进行调试，保证了实验室的正常、安全运转。

2.7.3 BSL-3实验室关键设备的维护实验室开展高致病性病原微生物实验离不开诸如恒温培养箱、显微镜、生物安全型离心机、生物安全柜等仪器设备的稳定运行，且核心工作间配置的仪器设备与普通实验室在生物安全要求方面有所区别。根据日常实验开展的情况，应及时添置符合实验需要且满足生物安全要求的仪器设备，以防疫情紧急状态下采购仪器设备受阻，影响实验的顺利开展。此外，核心区工作间处于负压通风状态，并受换气次数(每小时不少于12次[17])的影响，仪器设备容易出现故障。因此，平时需对仪器设备及时进行维护、校准和调整，以确保在应急响应时处于正常工作状态。

2.7.4 BSL-3实验室防护用品的储备BSL-3实验室的各类防护用品是实验室顺利开展实验的必备耗材，且多为一次性使用。因此实验室必须储备一定数量的个人防护用品，如防护性口罩、一次性防护服、靴套等。实验室应根据平时实验开展的情况，对防护用品的消耗情况计算、统计并及时补充。本实验室一般储备可用3～6个月的防护用品，以备疫情突发时急需。此次疫情中，在各方防护用品告急的情况下，本实验室因提前储备了防护用品及实验耗材，满足了SARS-CoV-2攻关组在开展实验时的需求。

3 结语

应急能力体现了BSL-3实验室平时的内涵建设。在实验室日常运行中，通过不断发现、纠正或整改问题，逐步优化管理体系以达到高效解决实际问题的水平；经BSL-3实验室工作人员团队和项目组成员之间的磨合，不断积累经验和提升能力，在紧急时刻才能迅速响应并保证实验室的安全运行。BSL-3实验室的硬件是实验室安全、有效运行的基础，而内涵建设是保障，双管齐下方能保证实验室安全、高效地运转。实验室内涵建设是软实力，涉及管理系统、风险评估、人员管理等多个方面。在实验室平时活动中，营造生物安全文化，提高生物安全意识，为应急能力建设奠定基础。BSL-3实验室运行过程中，会发生不同的问题，只有及时发现并找出解决的方案或方法并加以总结及优化管理体系，才能在应急响应时减少事故的发生，为疫情控制、科研攻关提供技术支撑和生物安全平台保障。