C反应蛋白基因单核苷酸多态性和环境交互作用与缺血性脑卒中的相关性分析

李晓峰，高永俊，崔重林，杨 旭，李新毅，王 征

炎症反应参与了动脉粥样硬化的发生及发展进程[1-2]，与缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)的发生及发展密切相关[3]。C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)作为一种急性时相炎性蛋白，其血浆浓度与动脉粥样硬化损伤程度呈正相关[4]。近年来研究报道认为部分CRP基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)不仅与血浆水平关联密切[5-6]，且可增加IS的发生及复发风险[7-9]，但结果颇有争议[10-11]。IS的发生是由遗传和环境因素共同作用的疾病，目前公认高血压病、糖尿病、肥胖、吸烟、饮酒等环境因素与80%的脑卒中发生相关[12]。在这些危险因素中，吸烟、饮酒是血管疾病的主要危险因素[13-15]。然而既往关于CRP与吸烟、饮酒交互作用对脑卒中的影响研究尚少。基于此，本研究拟通过病例-对照研究，根据既往研究阳性结果及HapMap数据库，筛选CRP基因2个标签SNP(rs1130864和rs1800947)，探讨其基因型、单体型与IS及其亚型发生的相关性，并进一步探讨了SNP与环境因素交互作用对IS发生的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究采用病例对照研究，IS组病人来源于2010年10月—2011年12月连续入住北京大学航天临床医学院神经内科病人236例，均为发病3 d内入选，男158例，女78例，年龄(67.14±9.69)岁。诊断依据全国第四届脑血管病学术会议修订标准，均经头颅CT或核磁共振(MRI)证实，并进行TOAST分型[16]，其中大动脉粥样硬化型脑卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)174例，小动脉闭塞性脑卒中或腔隙性脑卒中(small-artery occlusion，SAA)62例。对照组从同期体检中心选取非IS病人270例，男153例，女117例，年龄(66.79±6.51)岁。排除标准：其他类型脑卒中；近3个月有心、脑及周围血管疾病史；血液系统疾病、动脉炎、结核、肿瘤、外伤；半个月内有呼吸道、胃肠道等感染史；既往严重肝、肾功能疾病或曾接受过器官移植者。

1.2 方法

1.2.1 信息采集 本研究通过本院伦理委员会审查，所有研究对象均签署知情同意书。采用统一的调查问卷收集临床资料，包括年龄、性别、身高、体重、冠心病史、糖尿病史、家族史、吸烟史、饮酒史等。

1.2.2 SNP位点筛选 所有研究对象采集清晨空腹静脉血2 mL，-80 ℃冰箱冻存备用，采用AxyPrep基因组DNA试剂盒提取白细胞基因组DNA。登录人类HapMap计划数据库(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，选择SNP genotype data下载China Han Beijing(CHB)数据，并运行Haploview3.0软件(http：//www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中读取CHB数据，设置最小等位基因频率>0.01，以SNPs之间r2>0.8的原则，选择CRP基因标签SNP位点rs1130864与rs1800947。

1.2.3 引物设计及基因分型 采用Premier 5.0进行设计引物(上海英俊生物技术公司)，基因分型采用PCR-RFLP。PCR反应条件：总体积20 μL，含模板DNA10 ng，1.5UTaq酶，dNTP 0.2 mmol/L，2×PCR缓冲液10 μL，两种引物上下游引物各1 μL。PCR扩增循环条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25个循环，最后72 ℃延伸7 min。反应结束后，予以3%琼脂糖凝胶电泳，PCR 扩增结果采用凝胶成像分析系统观察。PCR产物由限制性内切酶(NEB公司)2 U进行消化，65 ℃温育1 h，以含溴化乙啶的3%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。rs1130864扩增段内另有2个酶切位点，测序结果证实此位点发生C>T置换，此次试验未发现TT基因型。rs1800947经PCR 扩增及酶切后证实发生G>C突变，未发现CC基因型。详见表1。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行数据分析。IS组和对照组间比较，计数资料采用χ2检验或Fisher 精确检验，计量资料比较采用t检验。两组间各SNP基因型分布频率差异采用χ2检验或Fisher精确检验。应用多因素Logistic回归校正相关危险因素，分析每个SNP基因型、等位基因对IS潜在独立作用，并对基因-环境交互作用进行分析。两组间单体型分布频率差异采用unPHASED软件(Version 3.1.4)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 除年龄、体质指数(BMI)外，IS组男性、高血压病、糖尿病、冠心病、家族脑卒中病史、吸烟史、饮酒史率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 两组临床资料比较

2.2 CRP基因SNP与IS及其亚型相关性 对照组rs1130864和rs1800947基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示具备人群代表性。两组间rs1130864基因型、等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组间rs1800947基因型频率分布差异有统计学意义[IS组：OR=2.205，95%CI(1.251，3.887)，P=0.005；LAA组：OR=2.178，95%CI(1.189，3.991)，P=0.010；SAA组：OR=2.280，95%CI(1.014，5.127)，P=0.042]。两组间rs1800947等位基因型分布差异有统计学意义[IS组：OR=2.102，95%CI(1.212，3.645 )，P=0.007；LAA组：OR=2.079，95%CI(1.156，3.739)，P=0.014]。详见表3。

表3 SNP与IS及其亚型的相关性分析

2.3 两组间单体型分布频率分析 据连锁不平衡系数>0.5为构建单体型标准，CRP基因rs1130864和rs1800947共构建3种单体型：C-G、T-G、C-C。结果发现，两组单体型C-C频率分布比较差异有统计学意义[IS组：OR=2.392，95%CI(1.325，4.320)，P=0.007；LAA组：OR=2.355，95%CI(1.260，4.401)，P=0.013]。详见表4。

表4 CRP单体型与IS及其亚型相关性分析

2.4 基因与环境因素交互作用分析 校正性别(男性)、高血压病、糖尿病、冠心病、家族脑卒中史后，吸烟病人携带rs1800947-GC基因型频率显著高于对照组[OR=6.276，95%CI(2.288，17.221)，P<0.001]，饮酒病人携带rs1800947-GC基因型频率高于对照组，差异有统计学意义[OR=9.207，95%CI(2.489，34.056)，P= 0.001]。详见表5。

表5 CRP基因rs1800947与环境交互作用与IS的相关性分析

3 讨 论

研究表明，CRP作为一种急性时相炎性因子，与动脉粥样硬化乃至IS的发生密切相关[4，17]。血清CRP蛋白水平受遗传因素的影响[18-19]，Martínez-Calatrava等[20]研究发现CRP基因rs1205、rs1130864、rs1417938、 rs1800947组成的单倍型CCATGCCT和CTATCCTT可解释2.9%的总血清水平变异。已有证据表明，CRP基因部分SNP可作为IS的独立危险因素[5-6]。本研究结果显示，rs1800947基因型频率分布差异有统计学意义，提示携带rs1800947-C等位基因IS组、LAA组的发生风险分别升高2.102倍、2.079倍，这一结果虽与Ladenvall 等[21]、Gonzlez-Giraldo等[10]不同，但与Morita 等[7]结果一致，其团队发现GC基因型可作为日本老年人群IS发生的独立危险因素。未发现rs1130864与IS的发生风险有关，与Morita等[7]、Kuhlenbaeumer等[9]研究结果一致，但美国Arenillas等[8]的一项队列研究结果不同，该研究认为rs1130864-T等位基因可作为IS复发的一个独立预测因子。本研究分析可能是由于研究方法、地域、种族、样本量、环境暴露因素等的差异，导致了争议结果的产生。本研究以rs1130864与rs1800947之间r2>0.8的原则，进行单体型构建，结果显示IS组单体型C-C频率显著高于对照组，提示单体型C-C趋于整体遗传，且可作为IS的独立危险因素，与Morita等[7]得出的结论一致，可能是由于共为亚洲人群。尽管本研究并非首例报道CRP基因SNP与IS的相关性研究，但基于既往研究结果不一致，从这项研究中获得的结果对于理解IS的机制是必要的，特别是对于CRP基因SNP与环境交互作用导致的IS易感性。

IS是由多种基因和环境因素共同作用的结果[22]，推测CRP基因SNP(rs1800947)与环境因素(吸烟、饮酒)在IS发生过程中存在显著的交互作用。通过多元Logistic回归发现吸烟者携带rs1800947 GC 基因型IS发病率显著升高，这一结论与Wu等[23]结论相似，其团队曾采用基因广义的多因素降维法和多元Logistic回归，发现CRP基因rs2794521和吸烟存在显著交互作用，吸烟者携带rs2794521-AA基因型较rs2794521-AG或GG基因型IS的发生风险显著升高。吸烟是动脉粥样硬化乃至IS的独立的危险因素之一，其可能损害血管内皮细胞，减少血管舒张因子，上调缩血管物质，并刺激肝细胞合成 CRP，二者可协同促进动脉粥样硬化及血栓形成[24-25]。同时本研究发现，大量饮酒者携带rs1800947-GC基因型IS发病率显著升高，差异有统计学意义，提示rs1800947-GC基因型与饮酒在IS的发生中存在显著的交互作用。大量饮酒不仅引发血糖和血脂的代谢紊乱促进动脉硬化的发生发展，还可促进白细胞介素-6(IL-6)释放，诱导肝脏产生急性时相蛋白CRP，通过改变血液凝固和纤维蛋白溶解等机制而增加 IS 的易患性。

本研究中亦存在一定的局限性。首先，采用病例对照研究，样本量偏小，不可避免地存在该研究类型局限性，需要谨慎分析结果，尚需进一步进行大样本前瞻性研究去证实；仅筛选了CRP基因两个突变频率较高的SNP，在以后研究中可考虑纳入更多的标签SNP。

rs1130864与IS的发生风险无关，CRP基因rs1800947-GC基因型、单体型C-C与IS的发生风险密切相关，可能是影响IS发生的独立危险因素。CRP基因rs1800947-GC基因型与吸烟、饮酒存在IS发生过程中显著的交互作用。