宏基因组二代测序法诊断细菌性脑膜炎的应用价值

尚 晶，上官丽娟，王燕宏，牛争平，杨丽白，侯苗苗，薛岚平

细菌性脑膜炎(bacterial meningitis，BM)是由细菌感染所致的严重中枢神经系统感染性疾病，常表现为发热、头痛、呕吐，严重者可出现谵妄、昏迷、呼吸衰竭等。近年来，细菌性脑膜炎的发病率呈上升趋势，据报道2013年全球该病发病率为每年1 300万人，其中160万人遗留不同程度的后遗症[1]。细菌性脑膜炎的高致死性及致残性，给社会和病人家庭造成严重的经济负担，严重影响病人及家庭的生活质量[2]。早期、及时的病原学诊断，可以指导临床医生准确选择抗菌药物，对于减轻病人的病情严重程度及改善预后具有重要意义，因此，对该病致病菌的确定至关重要。

目前，临床最常用的脑脊液细菌学培养是诊断细菌性脑膜炎的主要方法，将脑脊液病原菌进行分离、培养及鉴定，但其阳性率低、工作量大、耗时较长，不能及时提供可靠的诊断依据，不利于疾病的早期有效干预，导致不良预后，在临床应用中存在较大的局限性。近年来，随着检测技术的进步，二代测序以其“高通量优势”在临床中广泛应用，宏基因组二代测序法在中枢神经系统感染疾病病原学检出率及诊断水平提高中发挥重要作用，目前已应用于细菌性脑膜炎的诊断。本研究对山西某三级甲等医院2016年1月—2020年5月临床诊断为细菌性脑膜炎的41例病人进行回顾性分析，分析脑脊液培养与宏基因组二代测序方法的敏感性，探讨宏基因组二代测序技术与传统检测方法在细菌性脑膜炎病人脑脊液中提供病原学证据的效能差异及早前临床诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2020年5月在山西某三级甲等医院神经内科住院病人41例，由临床表现及脑脊液常规、生化检查初诊为细菌性脑膜炎，且行脑脊液培养或宏基因组二代测序治疗，均符合诊断标准。本研究遵循山西某三级甲等医院机构审查委员会、人体标本使用指南和法规建议，遵循《赫尔辛基宣言》，所有研究对象及其家属均签署知情同意书。

1.2 诊断标准 ①病人存在脑膜炎、脑炎或脑脊髓炎的临床表现或体征；②脑脊液化验符合细菌性脑膜炎变化特点；③病原学证据，包括细菌涂片检出病原菌、血细菌培养阳性等。

1.3 研究方案 回顾性分析41例病人临床资料，分析其临床表现、实验室与影像资料特点，根据病原菌检查方式的不同，在征得病人或其家属意见后将病人分组，脑脊液培养组及宏基因组二代测序组(包括脑脊液培养阴性者)，比较两组检测方法的阳性检出率及临床预后等。

2 结 果

2.1 两组临床特点 脑脊液培养组，41例病人中有39例行常规脑脊液细菌培养，年龄16～82(46.72±16.95)岁；男22例，女17例；37例以发热起病，25例之前有上呼吸道感染表现；9例有颅脑外伤、脑脊液鼻漏，2例有高血压及糖尿病，7例有高血压，1例有糖尿病，3例有中耳炎，1例有风湿系统疾病；7例起病时有痫性发作，其中6例为部分性继发全面性发作，1例为单纯部分性发作；31例存在不同程度意识障碍，其中嗜睡13例，昏睡7例，昏迷 11例；脑膜刺激征阳性21例。

宏基因组二代测序组，41例病人中有15例行脑脊液宏基因组二代测序，年龄23～82(51.64±17.63)岁；男9例，女6例；其中13例以发热起病，8例病前有上呼吸道感染表现；3例有颅脑外伤、脑脊液鼻漏，2例有高血压及糖尿病，4例有高血压，1例有糖尿病，1例有风湿系统疾病；3例起病时有痫性发作，3例均为部分性继发全面性发作；13例存在不同程度意识障碍，其中嗜睡5例，昏睡3例，昏迷5例；脑膜刺激征阳性9例。详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 实验室检查结果 所有病例均完善血细胞分析、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、肝功能、肾功能、电解质及脑脊液常规、生化等基础检验项目，39例病人均出现白细胞计数(WBC)及中性粒细胞计数增高，均存在不同程度CRP、PCT 增高，脑脊液中WBC增高，脑脊液蛋白出现不同程度增高。两组病人实验室检查结果见表2。

表2 两组病人实验室检查结果比较(±s)

2.3 影像学检查 41例病人中5例行头部CT检查，未见异常；39例完善头颅核磁共振(MRI)+DWI检查，其中23例出现影像学异常，1例为硬膜下积脓，22例表现为蛛网膜下腔内异常信号。

2.4 病原学检查 41例病人中39例行脑脊液培养，有6例明确了病原体，其中4例肺炎链球菌，2例单核细胞增生性李斯特菌，脑脊液培养组阳性检出率为15.38%。41例病人中15例进行了脑脊液二代测序，其中13例为常规脑脊液培养为阴性的病人；8例明确了病原菌，其中5例为肺炎链球菌，3例为单核细胞增生性李斯特菌；宏基因组二代测序组阳性检出率为53.33%。两组阳性检出率比较差异具有统计学意义(P<0.05)，表明宏基因组二代测序检出敏感度高于脑脊液培养组。详见表3。

表3 41例细菌性脑膜炎病人脑脊液宏基因组二代测序与脑脊液培养结果比较 单位：例

2.5 转归及预后 本研究41例病人中有8例出现预后不良，其中明确病原菌的病人预后相对较好(14例中仅2例预后差)，而未明确病原菌的病人预后差(27例中有6例预后差)。余病人均恢复良好，无明显后遗症。详见表4。

表4 8例预后不良细菌性脑膜炎病人基本状况

3 讨 论

细菌性脑膜炎是一种危及生命的中枢神经系统感染，致残率和致死率均很高。导致社区获得性细菌性脑膜炎最常见的病原体为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和单核增生李斯特菌，分别占70%、10%和5%[3-6]。病原菌常常侵袭力强，可侵犯中枢神经系统软脑膜，脑、脊髓实质，或感染临近的组织如静脉窦、周围神经等，其主要临床表现为感染症状、脑膜刺激征、颅内压增高及局灶症状等，实验室检查多表现为血白细胞计数增加，脑脊液压力升高、白细胞计数明显升高，蛋白质升高及糖含量下降。临床确诊需有病原学证据，如传统的细菌涂片检出病原菌、脑脊液或血培养阳性等。

本研究中41例病人临床及脑脊液常规生化等检验结果符合细菌性脑膜炎表现，30例为危重症病人，但病原菌不明，致使临床准确诊断及治疗困难。本研究脑脊液宏基因组二代测序检出阳性率可达53.33%，而传统脑脊液培养检出阳性率仅为15.38%，宏基因组二代测序结果不仅证实了初期的诊断，同时精准确定了病原菌，使治疗方向性更加明确，调整敏感抗菌药物，病人获得良好预后，减轻了病人的经济负担。本组有1例二代测序为单核细胞增生性李斯特菌的病人并发脑积水死亡，可能是因为病人发病早期基于常规脑脊液培养为阴性之后，进行的二代测序，延误了确诊和有针对性的抗菌药物应用治疗时机，提示应尽早进行二代测序检查，以减少并发症的发生和降低死亡率。

目前细菌性脑膜炎病原体检测方法包括脑脊液细菌涂片、培养、抗原检测等，但总体阳性率不高，60%～85%的病人不能获得明确的病原学诊断[7-8]。多数中枢神经系统感染病人病情危急，临床上多以脑脊液压力、外观、脑脊液常规与生化等实验室结果进行经验性诊断与治疗，造成初期治疗选择抗菌素的级别越来越高，容易造成抗菌素选择的盲目性与病原微生物的耐药[9-10]。自2005年宏基因组二代测序技术出现后，其优点日益突出，可以准确、高效地完成病原体检测，该技术在中枢神经系统感染性疾病病原学的诊断方面逐渐显示出较其他传统诊断方法的优越性，在脑脊液常见的病毒、细菌、寄生虫感染中较传统检验方法有较高的敏感性及特异性，脑脊液宏基因组二代测序已经成功应用于临床，对于新发病原体的鉴定具有重要作用[11-12]。但因宏基因组二代测序技术应用于颅内感染时间较短，尚缺少大样本的临床研究结论，目前宏基因组二代测序技术诊断单个病原体的标准尚不明确[13]，不同研究报道的诊断标准不一致[14]，主要参考覆盖度、病原体相对丰度或病原体的特异读数来制定[15]，尚需更多的数据及研究来制定统一检验诊断标准。