肾纤维化患者尿沉渣及尿外泌体源RNA的比较分析*

吕春燕, 徐亚吉, 汪弋力, 丁维俊△, 姚唯一, 赵梓亦,张嬿

1成都大学医学院 (四川成都 610106); 成都中医药大学 2基础医学院, 3临床医学院(四川成都 610072)

核糖核酸是广泛存在于各种生命体之中的遗传信息载体，包括信使核糖核酸(mRNA)和微核糖核酸(miRNA)[1]等。mRNA作为信使分子，将基因组脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid， DNA)的遗传信息传递至核糖体，指导核糖体合成肽链，实现遗传信息向蛋白质分子的转化。miRNA参与调节发育、防御、造血、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等途径[2-4]。mRNA和miRNA也存在于尿液中，可在一定程度上反映泌尿生殖道细胞的生理和病理状态。尿液的采集方便、无创，是一种理想的临床检测样本，可用于泌尿生殖道等疾病的检测[5]。如Bandyk等[6]报道了睾酮抑制前列腺信使-2 mRNA存在于尿液之中，可用于监测相关细胞损伤的程度。目前，尿RNA检测已广泛应用于多种疾病的诊断、预后和疗效评价[7-8]。外泌体是由细胞合成并分泌的双层膜性小囊泡[9-12]。尿外泌体主要由泌尿生殖道细胞分泌释放到尿液中，可特异性反映膀胱、肾脏和前列腺等组织细胞的生理病理状态[13-14]。外泌体脂质双分子层的包绕，对miRNA、mRNA等多种成分的稳定性具有重要作用。因此，这些外泌体之中的某些标志性成分，成为临床标志物研究热点[15-16]。近年来，不管是对尿沉渣还是外泌体源RNA的研究均得到了极大的关注。但是，关注尿沉渣和尿外泌体源RNA之间差别的报道却不多。本项研究对比分析了10例健康志愿者及10名肾纤维化患者的尿沉渣和尿外泌体中RNA的含量，以期发现稳定可靠的肾纤维化生物标志物。

1 资料与方法

1.1 样品收集和处理 本研究经过成都中医药大学附属医院伦理委员会批准同意，所有志愿者均被告知实验研究详情并签署知情同意书。收集2018年1月至2019年1月健康志愿者与肾纤维化患者各10例的第一或者第二次晨尿标本。所有志愿者均经成都中医药大学附属医院体检中心进行常规体格检查，以保证其健康状态。10例肾纤维化患者为在1周内经肾活检证实为肾纤维化的患者(小球类型不限)。所有研究对象的临床和实验室资料见表1。健康志愿者男6例，女4例，年龄(41.42±10.32)岁；肾纤维化患者男3例，女7例，平均年龄(40.70±13.42)岁。每位受试者采集尿标本20 mL，2 000 g离心10 min收集尿沉渣，加入Trizol提取沉渣RNA。上清液中加入适量聚乙二醇溶液，颠倒混匀，4℃静置过夜，4 000×g离心1 h，收集管底沉淀，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS液)稀释后分为二份，一份进行电镜和蛋白质印迹法(western blot)检测；一份加入Trizol提取RNA。

表1 10例肾纤维化患者基础疾病及纤维化程度表

1.2 qRT-PCR检测尿沉渣和尿外泌体RNA 分别以snRNA-U6和β-actin为内参基因，用Primer Premier V5.0软件设计引物(表2)，委托专业公司合成。Trizol法提取上述二种尿液成分的总RNA。按照M-MLV First Strand cDNASynthsis Kit (Omega Bio-TEK) 提供的操作说明书进行 cDNA 的合成。取 cDNA 以 SYBR® Green PCR Master Mix 进行qRT-PCR检测，同一标本另设2个复孔，反应程序为95℃ 5 s变性；60℃ 60 s退火加延伸，反应60个循环。

表2 目的基因和内参基因引物

1.3 统计学方法 以同一标本3次qRT-PCR检测RNA的平均循环阈值(Cycle threshold，Ct值)对该标本进行计算。以log2理论转化平均Ct值，进行倍数改变计算；以log10理论转化平均Ct值，作为该样品的正常读数，进行F检验，确定RNA结果分布范围。组间对比采用2-ΔCt理论，其中ΔCt=AvgCt目的RNA-AvgCt内参基因。采用t检验LSD法进行计算。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿外泌体的鉴定 经聚乙二醇富集的外泌体在电镜下表现为类圆形双层膜包绕囊泡，中央为低电子密度的凹陷区，大小介于30～120 nm之间，囊泡散在分布，部分聚集，背景散在小的沉淀物残渣(图1-A)。Western blot方法检测到外泌体特异性标志物CD63和CD9(图1-B)。

2.2 正常人尿沉渣和尿外泌体中RNA的表达水平 miR-21、U6、E-cadherin和Vimentin在尿外泌体中略高于尿沉渣中含量，但差异无统计学意义(P>0.05)。而miR-29 c和β-actin在尿外泌体中略低于尿沉渣中含量，差异也无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注：A：外泌体电镜图(×15k)；B：外泌体标志物Western blot检测结果

表3 RNA 在尿外泌体和尿沉渣中表达水平及倍数改变

2.3 健康志愿者qRT-PCR检测结果 所有健康志愿者，不管尿沉渣还是尿外泌体中miR-29c、miR-21和U6均可检测到，而E-cadherin、Vimentin和β-actin在所有尿沉渣中均可检测到，Vimentin在所有外泌体中均可检测到，1例志愿者尿外泌体中E-cadherin和1例志愿者尿外泌体中β-actin未检测到。以log10理论转化正常的读数，尿沉渣和尿外泌体中miR-29c、miR-21、U6和E-cadherin、Vimentin、β-actin的读数值分布见图2。两组总体均数差异无统计学意义(P>0.05)。外泌体源miR-29c、miR-21和E-cadherin与尿沉渣中相应RNA分布差异有统计学意义(P<0.05)，从图2-A、B、D可以看出外泌体源miR-29c、miR-21和E-cadherin比尿沉渣中相应RNA分布更一致，结果变异小，数值更加稳定；外泌体源U6和vimentin、β-actin与尿沉渣中相应RNA分布差异无统计学意义(P>0.05)，从图2-C、E、F中可以看出外泌体源U6和vimentin、β-actin与尿沉渣中相应RNA变异程度相当。见表4。

2.4 肾纤维化患者样品qRT-PCR检测结果 所有肾纤维化患者，不管尿沉渣还是尿外泌体中miR-29c、miR-21和U6均可检测到，而Vimentin和β-actin在所有尿沉渣中均可检测到，E-cadherin、Vimentin和β-actin在所有外泌体中均可检测到，2例肾纤维化患者尿沉渣中E-cadherin未检测到。以log10理论转化正常的读数，尿沉渣和尿外泌体中miR-29c、miR-21、U6和E-cadherin、Vimentin、β-actin的读数值见图3、表5。两组总体均数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。外泌体源miR-29c和E-cadherin与尿沉渣中相应RNA分布差异有统计学意义(P<0.05)，从图3-A、D可以看出外泌体源miR-29c和E-cadherin比尿沉渣中相应RNA分布更一致，结果变异小，数值更加稳定；外泌体源miR-21、U6和Vimentin、β-actin与尿沉渣中相应RNA结果差异无统计学意义(P>0.05)，从图3-B、C、E、F可以看出外泌体源miR-21、U6和Vimentin、β-actin与尿沉渣中相应RNA结果变异程度相当。

注：A：miR-29c；B：miR-21；C：U6；D：E-cadherin；E：Vimentin；F：β-actin

表4 健康志愿者尿沉渣和外泌体中RNAs表达水平情况

注：A:miR-29c；B:miR-21；C:U6；D:E-cadherin；E:Vimentin；F:β-actin

表5 肾纤维化患者尿沉渣和外泌体中RNAs读数值分布情况

而miR-29c相对含量(相对于U6)的在尿外泌体和尿沉渣中分别介于0.034～0.107 7之间和0.005～0.067之间，前者高于后者，且差异有统计学意义(P<0.05)。miR-21相对含量(相对于U6)在尿外泌体和尿沉渣中差异无统计学意义(P>0.05)。E-cadherin和Vimentin相对含量(相对于β-actin)在尿外泌体和尿沉渣中比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 肾纤维化患者尿沉渣和外泌体中RNAs相对含量情况

3 讨论

本研究探讨尿外泌体和尿沉渣中miRNAs和mRNAs表达的差异。从表达水平来看，尽管在健康志愿者尿沉渣和尿外泌体中miRNA和mRNA表达水平并不相同，但组间比较差异并无统计学意义(P>0.05)；而从表达量的变异情况来看，外泌体源miR-29c、miR-21和E-cadherin与尿沉渣中相应RNA结果却差异有统计学意义(P<0.05)；而外泌体源U6和Vimentin、β-actin与尿沉渣中相应RNA结果差异无统计学意义(P>0.05)，说明外泌体源RNA表达量比尿沉渣RNA表达情况更稳定，因此，具有更高的作为生物标志物的潜力。

尿液是一种复杂的生物体液，常可分离为多种成分，尿沉渣和尿外泌体是其中的两种重要成分。尿沉渣及尿外泌体中RNA已被广泛用于诊断和治疗肾脏疾病的生物标志物。Zavesky等[17]发现妇科肿瘤患者miRNA在尿外泌体和尿上清液中表达程度不同。Dijkstra等[18]也发现，在前列腺癌患者尿液中，外泌体作为一种稳定物质，可用于生物标志物的分析，其诊断价值与细胞沉渣不同。Hendriks等[19]比较分析了全尿、细胞沉渣和外泌体中前列腺特异性标志物PCA3和ERG的水平，结果发现在全尿中这些标志物水平最高，且在数字直肠镜检查后升高更加明显。与非前列腺癌患者相比，在前列腺癌患者中，PCA3和ERG在数字直肠镜检查后上述三种尿成分中均增高。Krishnamurthy等[20]发现外泌体源蛋白标志物比全尿分析能够更准确地反映糖尿病肾病的潜在蛋白改变，用于糖尿病肾病的监测。这些研究说明，检测不同的尿液成分具有不同的诊断价值。

肾纤维化是在各种肾脏疾病基础上发生的肾小球或肾间质内胶原纤维等成分沉积形成，是慢性肾功能不全的重要病理基础[21-22]。不论中药、西药，在早期肾纤维化形成阶段，均有一定的治疗效果[23-24]；但疾病发展到晚期，纤维化损害的肾脏几乎没有逆转的可能。因此，疾病的早期诊断，尤其分子标志物的诊断，起着越来越重要的作用。本研究中，我们发现miR-29c在尿沉渣和尿外泌体中明显不同，这可能是因为在不健康的个体，miRNA选择外泌体进行信号/物质转运的可能更大。因此，有必要对尿外泌体源miRNAs进行检测。

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。U6和β-actin是组织和细胞miRNA和mRNA qRT-PCR检测的公认内参基因之一，也常规沿用作外泌体源RNA的内参基因。但本研究发现，β-actin在外泌体中的表达稳定性并不高于其他基因，有几例标本外泌体源β-actin未检测出，因此，有必要对外泌体源内参基因进行深入研究[25-26]。

总之，在本研究中，我们检测和分析了尿外泌体和尿沉渣中的RNA(包括miRNA和mRNA)情况，这是第一次比较尿沉渣和尿外泌体中miRNA和mRNA的表达水平。我们的数据表明miRNA和mRNA在这两种成分中相似，但尿外泌体中部分miRNA和mRNA相对更稳定，肾纤维化患者尿外泌体中miR-29c表达量更高。这项研究可能为尿沉渣和尿外泌体源miRNA和mRNA的研究提供新的视角。