布地奈德联合孟鲁司特治疗小儿哮喘对抗凝血酶Ⅲ、CD5抗原蛋白和NLRP3炎症小体的影响*

高伟霞， 秦小菀， 刘阳， 丁显春， 朱永杰

南阳市中心医院 1急诊儿科, 2儿科一病区, 3儿科三病区(河南南阳 473009)； 2郑州儿童医院急诊科(河南郑州 450053)

哮喘是常见的慢性呼吸道疾病，对儿童的健康和生活质量有很大的影响[1]。全球哮喘患者多达3亿左右，且有逐年增高的趋势[2-4]。哮喘主要由中性粒细胞、肥大细胞等炎性细胞及组分参与的异质性气道疾病，临床主要表现为过敏性喘息，发病机制较复杂，诱因多且与遗传和环境因素相关[5-6]。炎症小体是机体内多种蛋白在内外刺激下形成的复合体，可通过调控促炎因子的释放对内外因子产生应答，参与哮喘的发病过程[7-8]。目前，吸入糖皮质激素是治疗儿童哮喘的首选药物，抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂和β2 受体激动剂为治疗儿童哮喘的常用药，且常联合使用[9]。本研究探讨布地奈德联合孟鲁司特治疗小儿哮喘的疗效和对血清抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、CD5抗原样蛋白(CD5L)和NOD样受体热蛋白结构相关蛋白3(NLRP3)的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年2月至2018年2月在我院接受哮喘治疗的患儿124例，男56例，女68例，年龄1.5～10岁，平均(5.7±3.6)岁，病程0.8～3.2年。轻度哮喘54例，中度哮喘45例，重度哮喘25例，选中患者均符合哮喘的诊断标准[5]。排除活动性肺结核、其他呼吸道疾病、近2周有呼吸道感染的患儿。分为布地奈德组(A组)51例患儿，男23例，女28例，年龄(4.7±3.0)岁，病程(1.8±0.45)年，轻度哮喘17例，中度哮喘25例，重度哮喘9例。布地奈德联合孟鲁司特组(B组)73例患儿，男33例，女40例，年龄(5.1±3.2)岁，病程(2.1±0.56)年，轻度哮喘37例，中度哮喘20例，重度哮喘16例。两组患儿的性别、年龄、病程和哮喘分型均差异无统计学意义(P>0.05)。按年龄、性别匹配选取同一时期体检的健康儿童40例作为对照组(C组)。本研究受医院伦理委员会批准，患儿家属知情并签署知情同意书。

1.2 方法 所有患儿入院以后均给予常规的化痰、吸氧和抗感染等治疗。A组：雾化吸入布地奈德(信宜药业有限公司 国药准字 H20161002)2 mL/次，吸入10～15 min/次，2 次/d。B组：雾化吸入布地奈德方法同上，2岁以下患儿睡前口服孟鲁斯特(国药准字 J20130047；杭州默沙东制药有限公司)4 mg/d，>5 岁患儿 5 mg/d，治疗3个月。治疗前后均检测1 s用力呼气容积(FEV1)、峰流速(PEF)，观察患儿用药后是否有不良反应。

1.3 qRT-PCR实验 检测研究对象外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA水平。利用人淋巴细胞分离液(上海索宝生物科技公司)分离外周血单个核细胞，加入细胞裂解液，利用Trizol总RNA 提取试剂盒(美国Invitrogen 公司)提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，吸光度A260值/A280值在1.80～2.20之间为合格品。以cDNA为模板，按照试剂盒说明对引物进行扩增，NLRP3上游引物 5′-GCTGGTCTTGAATTCCTCA-3′，下游引物5′-GGCACACGGATGAGTCTTT-3′，β-actin上游引物5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，下游引物5′-CGTACAGGTCTTTGC GGATG-3′，引物序列由上海生工生物公司设计合成。PCR反应条件：92℃ 5 min,92℃ 30 s，56℃ 60 s，70℃ 30 s，连续循环38次，每个样品设6个平行复孔。按照公式RQ=2-ΔΔCT计算外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA 表达水平。

1.4 ELISA实验 采集研究对象治疗前晨起空腹肘静脉血10 mL，分装于抗凝管中，以2 500 r/min的速度离心15 min，留取血清，放置-70℃冰箱中保存待用。AT-Ⅲ和CD5L酶联免疫吸附测定试剂盒购于上海研域化学试剂有限公司，严格按照说明书进行检测，每次均使用厂家提供的标准品和质控品。

1.5 疗效评定标准 显著有效：肺功能回复正常，咳嗽、气喘、憋喘、啰音等临床症状消失；有效：肺功能有所改善，咳嗽、气喘、憋喘、啰音等临床症状缓解，FEV1增加≥20%；无效：肺功能无明显改善，咳嗽、气喘、憋喘、啰音等临床症状缓解不明显。

2 结果

2.1 肺功能检测结果的比较 治疗前，A组、B组与C组相比，FEV1和PEF水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)；治疗前A组与B组相比，FEV1和PEF水平差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，A组和B组FEV1和PEF的水平均明显高于治疗前(P<0.01)；A、B两组间FEV1和PEF差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 治疗前后肺功能检测结果比较

2.2 两组患儿治疗后的临床疗效比较 B组总有效率90.4%，显著高于A组的84.3%，差异有统计学意义(2=7.18，P=0.028)。见表2。

表2 两组患儿治疗后的的临床疗效比较 例(%)

2.3 AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3检测结果比较 治疗前，A组和B组AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3 mRNA的水平无明显差异(P>0.05)，但与C组比较，AT-Ⅲ和NLRP3的水平升高，CD5L的水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，B组AT-Ⅲ的水平明显低于A组(P<0.001)，而B组和A组CD5L和NLRP3 mRNA的水平差异无统计学意义(P>0.05)。A组治疗后与治疗前相比，AT-Ⅲ和CD5L的水平无明显改变(t=0.48、1.52,P=0.638、0.150)，NLRP3 mRNA的水平在治疗后明显降低(t=10.28、P=0.000)；B组治疗后与治疗前相比，AT-Ⅲ和NLRP3 mRNA的水平降低，CD5L的水平升高(t=5.35、11.10、2.32,P=0.000、0.000、0.034)。见表3。

表3 治疗前后AT －Ⅲ、CD5L 和NLRP3 检测结果比较

3 讨论

支气管哮喘是一种全球性的慢性气道持续性炎症疾病，根据世界卫生组织(WHO)报告，中国支气管哮喘患者人数高达3 000万，且呈逐年上升趋势[10]。婴幼儿哮喘多数在上呼吸道病毒感染后诱发，起病较缓慢，而儿童哮喘多由吸入变应原诱发，起病较急[11-13]。支气管哮喘以气道高反应性为主要临床特征，其发病率受遗传因素和环境因素的共同影响，但其具体的发病机制尚不清楚[14]。研究报道，支气管哮喘与气道炎症，过敏反应以及神经肿瘤和其他因素密切相关[15]。布地奈德是一种常见的糖皮质激素药物，具有很强的抗炎和免疫抑制作用。然而，长期使用会导致明显的不良反应和戒断效应[16]。孟鲁司特是一种半胱氨酰白三烯(Cys-LT)受体的拮抗剂，可以调节白三烯途径，临床上用于哮喘的急性和长期治疗，目前广泛应用于治疗哮喘儿童[17]。布地奈德与孟鲁司特的联合使用可减少糖皮质激素的用量，提高治疗的效果。

儿童哮喘可诱发气道损伤，增加气道反应性，主要以淋巴细胞和巨噬细胞等炎症因子相关[18]。降低气道的高反应性是治疗的关键，也是判断是否有效的关键环节[19]。本研究主要比较布地奈德单独治疗和布地奈德与孟鲁司特联合治疗的疗效和对患儿血清中AT-Ⅲ、CD5L和单个核细胞中NLRP3 mRNA水平的影响。治疗前，布地奈德单独治疗组和布地奈德与孟鲁司特联合治疗组与C组相比，FEV1、PEF的水平明显降低，且差异有统计学意义，治疗后FEV1、PEF的水平有显著的提高。B组患儿的总有效率高达90.4%，明显高于布地奈德单独治疗组84.3%，说明布地奈德联合孟鲁司特治疗效果优于布地奈德的单独使用。目前，AT-Ⅲ、CD5L和NLRP3为小儿哮喘中研究较多的生物标记物[20-21]。AT-Ⅲ为肝脏、血管内皮细胞及巨核细胞合成的一种糖蛋白,主要参与体内凝血和抗凝过程,哮喘患儿体内常呈慢性缺氧状态,可引起血管内皮细胞损伤,或导致内皮细胞功能紊乱,造成AT-Ⅲ大量释放[22]。CD5L 与血清中的IgM 结合,是Th17 细胞功能调节因子,而Th17 细胞作为重要的免疫细胞亚群,可维持组织稳定性、参与抵抗外界抗原的入侵,对评估哮喘患者病情及预后有一定的意义[23]。NLRP3由含有CARD 结构域的凋亡相关斑点样蛋白和含半胧氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶相互作用组成，不仅在细菌等病原体导致的固有免疫应答中发挥重要作用，而且与非感染性炎症反应关系密切[24-26]。治疗前，布地奈德单独治疗组和布地奈德与孟鲁司特联合治疗组与C组相比AT-Ⅲ和NLRP3的水平升高，CD5L的水平降低。经过3个月的治疗后布地奈德联合孟鲁司特AT-Ⅲ和NLRP3的水平降低，CD5L的水平升高，与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.05)。布地奈德单独治疗组AT-Ⅲ的水平降低，CD5L的水平升高但与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05)，而NLRP3的水平明显降低与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，布地奈德与孟鲁司特联合使用治疗小儿哮喘疗效优于布地奈德单独治疗，血清中AT-Ⅲ与CD5L的含量和NLRP3 mRNA的水平均有明显改善。