微波预处理条件对苹果汁品质的影响

张婷婷 蒲云峰 刘 懿 叶兴乾 刘东红，2*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 浙江大学馥莉食品研究院 杭州310058）

苹果为蔷薇科（Rosacea）苹果属（Malus Mill）多年生木本植物， 是我国栽培历史最久、 面积最大、产量最高的果树[1]。 苹果富含可溶性糖、氨基酸、有机酸、膳食纤维和微量元素等营养成分，此外，还含有大量黄酮、酚酸、原花色素三萜类等功能活性成分[2-3]。 据2018年中国统计年鉴数据，我国苹果产量达到3 923.3 万t。目前，苹果除了鲜食外，主要用于苹果汁加工。 然而，苹果中多酚氧化酶活性高，在苹果汁加工过程中易发生酶促褐变，导致苹果汁产品色泽加深，商品价值降低。

目前，除了传统的热处理方法，在预防果汁褐变方面，研究人员已做多种尝试。 Sun 等[4]发现超声处理鲜榨苹果汁，可抑制果汁褐变。 Bi X 等[4]采用脉冲电场对苹果汁进行处理， 发现随着脉冲电场强度的增强以及脉冲上升时间的增加， 多酚氧化酶的活性也随之降低。 Du Y 等[6]研究得出0.1 mmol/L 植酸能够同时降低苹果汁酶促褐变和非酶促褐变，从而延长苹果汁的货架期。 Suh 等[7]发现从皱叶酸模种子中提取的天然化学物质能够抑制鲜榨苹果汁的褐变。Klimczak 等[8]采用不同浓度的绿茶提取物抑制混浊苹果汁的褐变， 发现随着浓度的升高， 在短存储期内对混浊苹果汁褐变的抑制效果较好。

从现有文献来看， 现有的技术均能够有效灭酶或抑制酶活，从而降低苹果汁褐变程度。这些研究均以苹果榨汁后的苹果汁为研究对象， 忽视了打浆和制汁过程可能发生酶促褐变。 与传统热处理方法相比， 微波处理能极大地缩短加热时间并保持食品的天然品质[9]。 Marszałek 等[10]研究发现，微波处理可以更好地保持草莓酱的品质及色泽。张少颖等[11]发现微波预处理苹果块能有效抑制果汁褐变。本文提出采用微波处理对苹果整果灭酶，然后制备苹果汁， 以期为有效控制苹果汁酶促褐变提供一种新的加工方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择成熟度相同、外观无损伤及明显病虫害、大小均匀， 质量范围在200～250 g 的中等大小新鲜富士苹果，洗净待用。

交联聚乙烯基吡咯烷酮 （PVPP，USP 级）、2，6-二氯靛酚钠盐水合物 （＞95.0%）、Triton X-100（生化级）、聚乙二醇6000，阿拉丁；福林酚试剂（生化试剂）、三水合乙酸钠（分析纯）、二水合草酸（优级纯）、邻苯二酚（化学纯）、无水碳酸钠（分析纯）、醋酸（优级纯）、浓盐酸（优级纯）、氯化铁（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；水溶性维生素E（Trolox）、2， 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2， 4， 6-三（ 2-吡啶基）三嗪（TPTZ），美国Sigma 公司。

1.2 设备与仪器

JYL-D022 型多功能全自动果汁机，九阳股份有限公司；微波炉（W25800k-01AG），宁波方太厨具有限公司； 超声波清洗装置 （50Hz， 功率240 W），深圳市吉利特超声洗净设备有限公司； PHS-550 型pH 计， 陆恒生物；1510 型全波长酶标仪，Thermo Fisher；UV-2550 紫外分光光度计，日本岛津公司；ColorFlex EZ 色差仪， 鼎韵中国公司；高效液相色谱仪，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

微波灭酶处理： 将新鲜苹果洗净， 置微波炉中，微波处理后迅速置4 ℃冰箱冷却60 min。 苹果中心温度情况见表1 所示（因苹果多酚氧化酶的失活与温度密切相关， 故测其中心温度变化情况）。加入与苹果等质量的水，切块、去核、打浆。用4 层纱布过滤得到苹果浊汁。

微波处理功率为480，640，800 W， 处理时间为120，140，160，180 s（微波处理时间过长，使苹果皱缩破裂，导致水分流失，本试验将处理的最长时间设为180 s）。 共12 组微波处理，本试验每组重复3 次，总共36 个样品。 未经处理的样品作为空白组（记为CK）与之对比。

表1 不同微波条件下的苹果中心温度情况（℃）Table 1 The central temperature （℃）of apple under different microwave conditions

1.3.1 色泽的测定[12]采用色差仪测定30 mL 果汁的L*、a*、b*值。 褐变指数（BI）根据以下公式计算：

式中：X=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）

1.3.2 多酚氧化酶的测定 参考曹建康[13]的方法。 取5 mL 提取缓冲液（含1 mm PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）于10 mL 果汁中，摇匀，4 ℃下离心10 min， 取上清液100 μL 加入3 mL 0.2 mol/L 邻苯二酚缓冲液， 于波长420 nm 处测吸光度变化。 以每升样品每分钟吸光度变化值增加1为1 个活性单位。

1.3.3 总酚含量的测定[14]称取10 mL 果汁与20 mL 甲醇匀浆， 定容50 mL， 然后超声30 min，离心，备用。 在10 mL 试管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚试剂， 混匀静置5 min 后，加3 mL 0.1 mol/L 碳酸钠，最后用蒸馏水定容，充分混匀后避光反应2 h， 于波长760 nm 处测定吸光值。

1.3.4 可溶性醌含量的测定[15]取1.3.3 节离心后的上清液于波长437 nm 处测其吸光度。

1.3.5 抗氧化能力的测定

1.3.5.1 FRAP 法 准确移取20 μL 样液于96 孔板中，加入配好的150 μL TPTZ 工作液，37 ℃震荡反应10 min，测定波长593 nm 处的吸光值。 根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力， 结果用等价抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.5.2 ABTS 法 准确移取 20 μL 样液于96孔板中， 加入配好的170 μL ABTS 工作液，37 ℃震荡反应10 min， 测定波长734 nm 处的吸光值。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力， 结果用等价抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC， mg/L）。

1.3.6 高效液相法测定苹果汁中酚类化合物含量 样品储备液的制备： 将上述总酚测定粗提取液经0.22 μm 的滤膜过滤，得样品储备液。

色谱条件：色谱柱：Spursil C18 （250 mm×4.6 mm）；流动相：甲酸-甲醇溶液（20 ∶80，V/V）；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL/L； 流动相梯度洗脱条件见表2[16]。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution steps

1.4 数据统计分析

试验各处理均重复3 次， 求其平均值和标准差，结果用x±s 表示。 用SPSS 软件进行方差及显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 微波预处理对苹果汁褐变的影响

图1 微波预处理对苹果汁褐变指数的影响Fig.1 Effect of the microwave pretreatment on browning index of apple juice

2.1.1 微波预处理对苹果汁褐变指数的影响 作为褐变的信号之一， 褐变指数的上升意味着褐变程度的加深[17]。 由图1 可知，微波组褐变指数显著低于CK 组（P＜0.01）。可见微波预处理能更好地抑制苹果汁褐变，且微波功率越高，处理时间越长，褐变抑制效果越好。 在140 s 时，480，640 W 和720 W 功率处理的果块， 其果汁褐变指数分别比CK 降低54.4%，65.7%及69.9%。 在微波功率800 W，处理时间超过140 s 时，褐变指数变化不显著（P＞0.05）， 这可能与微波时间延长导致的苹果中心温度过高，处理过度，进一步引发剧烈的美拉德反应有关[12]。

2.1.2 微波预处理对苹果汁多酚氧化酶活性的影响 多酚氧化酶（PPO）是一种促进酶促褐变的含铜酶。PPO 可分为两类：漆酶（EC 1.10.3.2）及分布在植物中的多酚氧化酶（EC 1.10.3.1）[18]。 在氧气存在条件下，多酚氧化酶催化两个反应：一是单酚的羟基化，二是邻苯二酚氧化为邻苯二醌。果汁生产加工过程中，打浆、破碎、均质等环节均会引入空气，从而导致苹果内酚类物质被氧化。由图2 可知，随着微波功率的增大以及时间的延长，微波预处理对多酚氧化酶活性的抑制效果明显。此外，苹果中心温度随着微波功率的增大及时间的延长而增高（见表1）。 在微波800 W，180 s 条件下，苹果中心温度为96.7 ℃， 冷藏1 h 后中心温度为58.1℃，对PPO 起到较好的灭酶作用，此时PPO 活性仅为CK 组的19.6%。 Valadez-Carmona L 等[19]发现微波加热能使可可荚壳内PPO 活性降低66%。Zhou L 等[20]采用不同微波功率处理鳄梨酱，发现微波功率密度越高， 对PPO 活性抑制效果越明显，说明微波预处理能达到灭酶效果。

图2 微波预处理对苹果汁多酚氧化酶活性的影响Fig.2 Effect of the microwave pretreatment on polyphenol oxidase activity

2.1.3 微波预处理对苹果汁可溶性醌的影响 作为酶促褐变的产物之一， 可溶性醌的增加在一定程度上意味着苹果汁中黑色素的累积。 由图3 可知， 通过比较微波功率一致而处理时间不同对果汁可溶性醌的影响，发现在微波功率480 W 时，随着微波时间的延长，可溶性醌含量下降显著（P＜0.05）， 时间延长至180 s， 其可溶性醌含量降低84.1%，说明该条件下微波时间越长对褐变的抑制效果越好， 而在微波功率640 W 及800 W 时，可溶性醌含量随时间变化不大。 进一步观察同一微波时间下不同功率对可溶性醌的影响， 发现微波功率640 W 和800 W 的可溶性醌含量明显低于480 W 处理的样品。 可见，在一定范围，随着微波功率的增大及时间的延长， 对苹果汁褐变的抑制效果越好。

2.2 微波预处理对苹果汁营养品质的影响

图3 微波预处理对苹果汁可溶性醌含量的影响Fig.3 Effect of the microwave pretreatment on polyphenol soluble quinone

2.2.1 微波预处理对苹果汁总酚含量的影响 作为次生代谢产物， 苹果多酚包括酚酸和类黄酮类成分[21]。 苹果中的酚酸主要有绿原酸、阿魏酸、咖啡酸等；而苹果中的类黄酮类主要包括儿茶素、表儿茶素及槲皮素等。 由图4 可知，在同一功率下，随着时间的延长，总酚含量呈现先增后减的趋势，这可能是温度过高， 导致热不稳定性物质被破坏[22]。在功率480，640 W 及800 W 下，苹果汁中总酚含量分别在处理时间160，160 s 及140 s 达到最高，在微波800 W、140 s 条件下总酚含量达到3 456 mg/kg，是对照组的2.2 倍。 这说明微波预处理使PPO 在接触空气之前被大量灭活，导致果汁中酚类底物未被大量氧化。另外，微波处理可能破坏细胞壁，导致细胞质溶出，从而促进细胞内大量酚类物质的释放。

图4 微波预处理对苹果汁总酚含量的影响Fig.4 Effect of the microwave pretreatment on total phenols

2.2.2 微波预处理对苹果汁主要酚类物质含量的影响 由表3 可知， 苹果汁中含量较高的小分子酚类物质如绿原酸、儿茶素、表儿茶素等经微波预处理后其含量均显著升高（P＜0.05）。 微波640 W、160 s 条件下，绿原酸含量为空白处理的9.1 倍。研究微波功率及时间变化对绿原酸的影响， 可看出绿原酸含量随功率的升高及时间的延长呈先上升后下降趋势。 这可能是由于微波处理初期较高的温度导致苹果细胞破裂， 加速液泡内酚类物质的溶出，使得绿原酸含量升高，然而继续增大功率并延长时间， 微波引发的热效应使得具有不稳定性的绿原酸含量减少。观察儿茶素及表儿茶素，其含量变化趋势与绿原酸相近。与绿原酸相反，苹果汁中芦丁等黄酮类物质经微波处理后含量显著降低（P＜0.05）。Huang 等[23]发现采用蒸汽加热法处理甘薯导致总黄酮含量减少了25%。可见，芦丁等物质含量的降低可能与其不耐热性密切相关。

2.3 微波预处理对苹果汁抗氧化能力的影响

由于反应机制和特性差异， 所以抗氧化能力测定通常使用两种及以上方法[24]。 采用ABTS 及FRAP 评价不同微波条件下苹果汁的抗氧化能力。由图5 可知， 在微波时间120～160 s 范围，3 个功率条件下抗氧化能力与功率及时间呈正相关。 而微波时间为180 s 时， 微波功率800 W 处理的样品的抗氧化能力小于640 W 处理的样品，这可能与该条件下总酚含量下降有关。为验证这一假设，评估这两种抗氧化能力与总酚之间的相关性，结果显示， 总酚与ABTS 及FRAP 均有较为显著的相关性，相关系数分别为0.740（P＜0.01）和0.838（P＜0.01）。 上述相关性分析表明苹果汁中酚类物质是苹果汁抗氧化能力的重要物质基础。 而微波预处理则能显著提高苹果汁的抗氧化能力 （P＜0.05）。

表3 微波条件对苹果汁主要酚类物质含量的影响（mg·kg-1）Table 3 Effect of the microwave treatment on main single phenolic composition （mg·kg-1）of apple juice

2.4 微波预处理对苹果汁各指标的影响

以功率（480，640，800 W）和时间（120，140，160，180 s）及空白对照为X 变量，15 个果汁指标为Y 变量作PLS2 分析，结果如图6 所示。 不同微波预处理条件对苹果汁各指标的影响是多维的复杂的数据信息。为了简洁、清楚地呈现样品智能感官特征， 利用化学计量学工具对复杂而庞大的多维数据进行处理。 主成分分析（principal components analysis，PCA）是一种无监督分析，可在未知样品分类信息的情况下将样品聚类分组。 PCA通过将多指标（多维）的信息进行数据转换和降维， 对降维后的特征向量进行线性分类， 然后在PCA 得分图上显示主要的二维得分图。 由图6 可知PC1 和PC2 分别为97%和2%， 共贡献率为99%。 一般认为所得主成分总贡献率超过85%时此方法可使用。总贡献率越大，主成分对原来多指标信息的反应效果越好。由图6 可知，不同处理样品的差异主要体现在第1 主成分。 其中空白处理与褐变指数、多酚氧化酶活性较近，与多数酚类物质较远，说明未经处理的苹果汁存在褐变问题；而不同微波预处理条件中， 微波条件640 W、160 s，800 W、140 s，800 W、160 s 与酚类物质近，与褐变指数、多酚氧化酶活性远，说明这3 个条件能较好地抑制褐变， 在一定程度上提升苹果汁的营养品质。其中，800 W、140 s 用时较短，距酚类物质更为接近，从节能角度考虑，选择微波条件800 W、140 s 作为抑制苹果汁褐变的较优条件。

图5 ABTS 法（A）和FRAP（B）法测定不同微波条件下苹果汁的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant activity of apple juice determined by ABTS （A）and FRAP （B）at different microwave pretreat

图6 PLS2 分析的二维主成分效果图Fig.6 The PLS2 correlation loadings plot

3 结论

目前， 市场上常见的苹果汁产品为苹果清汁及苹果浊汁[25-26]。 苹果清汁经历酶解、澄清过滤等过程， 造成果汁中部分有益于人体的酚类、 蛋白质、纤维素等损失，而浊汁含有较多的果胶、蛋白质以及纤维素等，营养价值高于清汁[27]。 苹果汁的褐变主要包括酶促褐变及非酶褐变。 非酶褐变主要发生在贮藏过程中， 通常归因于抗坏血酸和美拉德反应，由于高糖和低抗坏血酸含量，所以引起苹果汁贮藏过程中非酶褐变的主要原因为美拉德反应[28]。 酶促褐变主要发生在加工过程中，酚类物质在氧气存在的情况下将氧化为醌[29]。 苹果汁的褐变伴随着色泽的改变，营养价值的流失，最终导致商品价值下降。 本文研究经不同微波条件预处理所得苹果汁的褐变及品质特性，得出以下结论：

1）抑制褐变方面 与空白组相比，微波预处理能显著降低苹果汁的褐变指数， 抑制多酚氧化酶活性且有效降低果汁中可溶性醌的含量（P＜0.05）。

2）苹果汁营养品质方面 微波预处理能显著提高果汁中总酚及酚类物质的含量（P＜0.05）。

3）苹果汁抗氧化能力方面 与空白对照相比，微波预处理能显著提高苹果汁抗氧化能力（P＜0.05）。

4）经主成分分析，微波条件800 W、140 s 可作为抑制苹果汁褐变的较优条件。