肾血管性高血压大鼠心脏功能及心脏组织中ACE及AT1的mRNA和蛋白表达的性别差异

买买提吐尔·克力木 邬利娅·伊明 阿瓦古丽·达吾提

[摘要] 目的 觀察肾血管性高血压大鼠心脏功能及心脏组织中血管紧张素转化酶（ACE）及AT1的mRNA和蛋白表达的性别差异。方法 75只SD大鼠采用两肾一夹（2K1C）法建立肾血管性高血压大鼠模型，并将其中25只雌性大鼠通过切除双侧卵巢制备雌激素低下的肾血管性高血压模型。75只SD大鼠共分为3组，即雄性2K1C组（2K1C-M组）、雌性2K1C组（2K1C-F组）、雌性去势手术组（2K1C-OVX组），每组25只。于32周时测体重行心脏血流动力学检查后，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗后液氮冻存，留取部分左心室心肌组织标本，用免疫印迹检测蛋白表达，RT-PCR检测组织中相关分子的mRNA表达。 结果 血流动力学结果显示，2K1C-OVX组的收缩压明显低于2K1C-F组，差异有统计学意义（P < 0.05）。2K1C-OVX组室内压最大下降速率明显高于2K1C-F组，差异有统计学意义（P < 0.05）。RT-PCR的结果显示，2K1C-M组的ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，而ACE2的mRNA表达量低于2K1C-F组和2K1C-OVX组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。在蛋白表达方面，2K1C-M组的AT1蛋白表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，而ACE2蛋白表达量低于2K1C-F组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 肾血管性高血压大鼠心脏功能及心脏组织中ACE1及AT1的mRNA和蛋白的表达存在性别差异。

[关键词] 性别差异;肾血管性高血压;心脏功能;肾素-血管紧张素系统

[中图分类号] R544.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate gender difference of cardiac function and the angiotensin converting enzyme （ACE） and AT1 mRNA and protein expression in heart tissue of renovascular hypertensive rats. Methods The renovascular hypertensive rat model was established in 75 SD rats by two-kidney one-clip （2K1C） method and 25 female rats among them were prepared with low estrogen renovascular hypertensive model by removing bilateral ovaries. A total of 75 SD rats were divided into three groups， namely， male 2K1C group （2K1C-M group）， female 2K1C group （2K1C-F group）， and female ovariectomized group （2K1C-OVX group）， with 25 rats in each group. At 32 weeks， weight was measured and cardiac hemodynamics was performed and then the heart was quickly taken out， rinsed with normal saline and frozen in liquid nitrogen. Part of the left ventricular myocardial tissue specimens were left， protein expression was detected by Western blot， and mRNA expression of relevant molecules in the tissue was detected by RT-PCR. Results The hemodynamic results showed that the systolic blood pressure of the 2K1C-OVX group was significantly lower than that of the 2K1C-F group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The maximum indoor pressure drop rate in the 2K1C-OVX group was significantly higher than that in the 2K1C-F group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. RT-PCR results showed that ACE1， AT1a and AT1b mRNA expression levels of the 2K1C-M group were higher than those of the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， while ACE2 mRNA expression level was lower than that of the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. In terms of protein expression， the AT1 protein expression level in the 2K1C-M group was higher than that in the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， while ACE2 protein expression level was lower than that in the 2K1C-F group， with statistically significant difference （all P < 0.05）. Conclusion The cardiac function， mRNA and protein expressions of ACE1 and AT1 in cardiac tissue show gender difference in renovascular hypertensive rats.

[Key words] Gender difference; Renovascular hypertensive; Cardiac function; Renin-angiotensin system

随着我国人民生活方式的转变和人口老龄化，心血管疾病已成为威胁人民健康的疾病之一[1]。高血压是心血管疾病的独立危险因素[2]。高血压患病率男性高于女性，随着年龄增长，女性升高幅度明显高于男性[3]。肾血管性高血压是肾动脉或主要分支的狭窄等诸多因素引起的疾病，是肾血流量减少所致的高血压，狭窄或缺血进一步导致肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）激活[4-5]，RAS由肾素、血管紧张素原、血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素（AngⅡ）及相关受体构成[6]。有研究表明，心脏组织存在局部RAS[7-10]，其对心肌细胞的增生，保持内环境稳定起到重要作用[11]。

本试验通过测定不同性别大鼠心脏局部RAS各组分蛋白及mRNA的表达，研究性别与肾血管性高血压大鼠心脏组织肾素-血管紧张素各组分蛋白及mRNA的关系，为今后学习及研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 试验动物  体重为180～200 g的SD大鼠共75只，雌性50只，雄性25只，购于新疆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（新）20160003，所有操作符合动物伦理学准则。所有实验动物进行两肾一夹（2K1C）手术，分为雄性2K1C组（2K1C-M组）、雌性2K1C组（2K1C-F组）、雌性去势手术组（2K1C-OVX），每组25只，术后4周用BP-6无创尾动脉测压仪测定血压，收缩压≥150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的大鼠进入实验。实验期间大鼠自由喂养，环境为SPF级。

1.1.2 试剂  AngⅡ放射免疫分析试剂盒和雌二醇放射免疫试剂盒由北京北方生物技术研究所提供;戊巴比妥钠（批号：92101，由Sigma公司提供）;蛋白定量（考马斯亮蓝）试剂盒（批号：20180117）;ACE1（批号：ab11 734）、AT1R（批号：ab9391）、AT2R（批号：ab 92445）抗体（由美国Santa Cruz公司提供）;HRP标记的二抗、免疫印迹增强化学发光试剂盒（由尚柏生物医学技术有限公司提供）;TRIzol、RNase inhibitor、Oligd（T）18、dNTPs，PCRbuffer，均由TaKaRa公司提供。

1.1.3 仪器  Powerlab生物信号处理系统（型号：PL35-08B55-V，由澳大利亚AD Instruments公司提供）;蛋白电泳及转膜仪（型号：MyCycler Thermal Cycler，由美国Bio-Rad公司提供）;紫外分光光度计（型号：UV-2802，由上海尤尼柯仪器有限公司提供）;Real time PCR仪（型号：ABI QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR Syste，由ABI公司提供）;数码凝胶图像处理系统（型号：2500，由上海天能科技有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 2K1C高血压动物模型的制作  75只SD大鼠均戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉。仰卧固定于手术台并常规备皮，沿腹部中线分别切开皮层和肌肉层，用镊子将腹内器官移到一边，分离及用内径为0.25 mm的U型银夹套住肾脏动脉。随后分层缝合切口，后肢肌肉注射青霉素钠8万U预防感染，完成2K1C手术。

1.2.2 双侧卵巢切除手术（OVX）  25只雌性SD大鼠戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后分离双侧卵巢，结扎卵巢动脉后切除双侧卵巢，术后给予青霉素（8万U）预防感染。常规饲养，室温20～25℃。

1.2.3 血流动力学测定  手术32周后，用戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定在操作台上，分离右侧颈总动脉插入PES0导管，压力传感器连接导管，信号输入至powerlab系统，并且信号稳定后，记录颈总动脉舒张压（DBP）/收缩压（SBP），再向左心室内推送导管，至出现明显的心室压波形，记录血液动力学参数，对不符合要求的给予剔除。

1.2.4 心脏标本收集  52只SD大鼠32周龄时测体重并行血液动力学测定后，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗后，液氮冻存。

1.2.5 组织匀浆液的制备  取心脏组织，称重，取9倍组织重量的预冷生理盐水，匀浆（15 000 r/min），制成10%的组织生理水匀浆液，4℃ 12 000 g离心10 min，收集上清液待测。

1.2.6 免疫印迹（Western blot）  整体动物实验样本中，提取蛋白质，每组3个样本，经SDS-page电泳，转移到硝酸纤维素薄膜后，以大鼠的RAS各组分特异性抗体，抗GADPH抗体等检测蛋白表达。

1.2.7 RT-PCR  取每组6只动物心脏组织100 mg，将组织液氮中研磨成粉末，加入1 mL TRIzol试剂，氯仿抽提和乙醇沉淀方法准备总RNA。检测RNA样本在260 nm和280 nm处的吸光度。在AMV逆转录酶的作用下，以20 μg总RNA为模板，逆转录成cDNA，总反应体系为25 μL，所得cDNA于-20℃冻存。待测样品均作复管，每次实验均以不加模板的PCR體系作为阴性对照。反应条件为：94℃，5 min（热启动），94℃，30 s（变性），65℃，30 s（退火），72℃，30 s（延伸），40个循环。结果用MJ Opticom monitor软件分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血流动力学参数比较

2K1C-OVX组SBP明显低于2K1C-F组，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组间DBP、左心室舒张末期压（LVEDP）、室内压最大上升速率（+dp/dtmax）比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;2K1C-OVX组-dp/dtmax明显高于2K1C-F组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组心脏组织中ACE1、ACE2、AT1a、AT1b的mRNA的表达

2K1C-OVX组ACE1的mRNA表达量高于2K1C-F组，差异有统计学意义（P < 0.05）;2K1C-M组ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，而ACE2的mRNA表达量低于2K1C-F组和2K1C-OVX组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 各组心脏组织ACE1、ACE2及AT1的蛋白表达比较

2K1C-M组的AT1蛋白表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，而ACE2蛋白表达量低于2K1C-F组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图1。

3 讨论

肾血管性高血压是肾动脉狭窄引起的肾实质缺血所致的高血压。常用2K1C大鼠作为该疾病的动物模型，该模型形成高血压的因素与其他高血压动物模型比较，影响因素较单一，可用来研究性激素体内RAS系统激活的影响。近期研究发现心脏、肾脏、血管等组织器官也有独立的RAS[12-15]，局部RAS在组织损伤和修复过程中起着重要作用[16-18]。

已有研究表明，高血压具有性别差异，绝经后女性血压高于同龄男性患者，本研究显示2K1C-F组的SBP高于2K1C-OVX组，其结果与前期试验结果相同[19]，关于性别与心脏局部RAS各组分的表达，各个实验室研究结果不尽相同[20]，本实验结果提示，2K1C-M组的ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，而ACE2的mRNA表达量低于2K1C-F组和2K1C-OVX组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;在蛋白表达方面，2K1C-M组的AT1蛋白表达量高于2K1C-F组和2K1C-OVX组，与前期研究结果有所不同[21]，本研究结果提示RAS各组分的mRNA的表达和蛋白表达的实验结果与预期结果不同，即有关RAS现有的实验结果不能解释雌性肾血管性高血压大鼠血压水平高于雄性的原因，可能与性别及卵巢切除手术对内源性血管收缩因子和舒张因子的影响有关。

总之，不同性别肾血管性高血压大鼠心脏功能及心脏组织肾素-血管紧张素各组分mRNA及蛋白表达有差别，进一步说明心脏组织局部RAS的存在，并且具有性别差异。

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（收稿日期：2019-11-12）