输卵管妊娠滋养细胞的体外培养与鉴定

简咏男 郑文兰

[摘要] 目的 探讨人输卵管妊娠滋养细胞体外培养的方法与鉴定。 方法 取在贵州中医药大学第一附属医院妇科住院部住院的早期输卵管妊娠3例患者的绒毛组织，采用胶原酶-胰酶混合消化法消化细胞，差速贴壁法纯化分离细胞，最后通过免疫荧光共聚焦方法对培养出的细胞进行细胞鉴定。 结果 免疫荧光双标记染色检测到角蛋白与波形蛋白共表达。 结论 通过显微镜和免疫荧光检测细胞外形和骨架，初步判定该细胞可能为滋养细胞。

[关键词] 滋养细胞;原代培养;细胞鉴定;胎盘绒毛;胰酶消化

[中图分类号] R711          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（a）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the methods and identification of tubal pregnancy trophoblasts in vitro. Methods The villi of 3 patients with early tubal pregnancy admitted to the Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine were taken. Collagenase-trypsin mixed digestion method was used to digest cells， and differential adherence method was used to purify and isolate cells. Finally， the cells were identified by immunofluorescence confocal method. Results Co-expression of keratin and vimentin was detected by immunofluorescence double-labeling staining. Conclusion Microscope and immunofluorescence can detect cell shape and skeleton. It is preliminarily determines that the cell may be a trophoblast cell.

[Key words] Trophoblast cell; Primary culture; Cell identification; Placental villi; Trypsin digestion

近年来，异位妊娠发病率呈现年轻化趋势，且逐年上升，为保留治疗后输卵管的完整性，提高今后的再次受孕率，中药治疗因其副作用小而备受人们关注，且在临床治疗中也取得了满意的效果，但其机制研究尚处于初级阶段。由于在人体无法进行相关的在体研究，因此输卵管妊娠绒毛滋养细胞的体外培养便成为进行相关实验研究的前提。本研究将早期的人输卵管妊娠患者的绒毛组织进行体外培养，为后期输卵管妊娠疾病的相关研究提供较好的模型，为推动中药治疗异位妊娠滋养细胞疾病提供良好的实验基础。

1 材料与方法

1.1 绒毛组织

选取在贵州中医药大学第一附属医院妇科住院部住院的早期输卵管妊娠患者3例，妊娠周數为孕5～8周，平均（6.33±0.58）周;孕妇年龄20～30岁，平均（26.67±2.08）岁;无其他疾病;未经药物治疗;直接手术的输卵管妊娠患者的新鲜绒毛组织。患者本人对本研究知情同意。

1.2 主要试剂及仪器

胶原酶Ⅰ（货号：C8140）、DAPI染色液（货号：C0065）、5%BSA封闭液（货号：SW3015）、曲拉通X-100（货号：T8200）：北京索莱宝生物科技有限公司;PBS缓冲液（货号：SH30256.01）、胰酶消化液（货号：SH30042）、胎牛血清（货号：SH30406.02E）：美国HyClone;异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人角蛋白18（货号：bs-2043R）、荧光素（Cy3）标记的鼠抗人波形蛋白（货号：bs-0756R）：北京博奥森生物技术有限公司;4%多聚甲醛（货号：DF0135）：安徽雷根生物技术有限公司;倒置显微镜（型号：BX41TF）：日本Olympus;激光共聚焦显微镜（型号：DM4000B）：德国Leica;高速冷冻离心机（型号：Microfuge 20R）：美国Beckman Coulter。

1.3 滋养细胞的取材及培养

根据文献[1]将输卵管妊娠的绒毛组织在无菌条件下置于含双抗（青霉素、链霉素）的PBS中，取样1 h内冰上运送至实验室。于超净工作台内，PBS反复洗涤绒毛组织以去除血污，眼科剪将组织剪碎至1 mm3左右，收集至离心管中，1000 r/min，离心10 min，弃上清，加入0.125%胰酶+0.1%Ⅰ型胶原酶1∶1复合消化液，37℃水浴中将其消化20 min。消化完毕后加入10%胎牛血清（FBS）终止消化，离心，弃上清。加入含20%FBS的培养液悬浮细胞，反复吹打混匀后接种于培养瓶中，放置在37℃二氧化碳培养箱中继续培养。24 h首次换液，以后每隔48 h常规换液 1次。

1.4 差异贴壁法分离滋养细胞

当细胞贴壁生长至80%～90%时，吸去培养液，PBS洗后加入0.25%胰酶消化细胞并置于二氧化碳培养箱中孵育5 min，加入10%FBS终止消化，1000 r/min，离心5 min，弃上清。铺入新的培养瓶中，加20%FBS培养液3 mL，轻轻吹打后，于二氧化碳培养箱中静置20 min，采用差速贴壁法将其进行分离纯化，在显微镜下观察到最先贴壁的为成纤维细胞，滋养细胞大多为悬浮细胞，将其悬浮的培养液收集于另一培养瓶中，重复5次后铺瓶，放置于37℃二氧化碳培养箱内培养。

1.5 倒置显微镜观察

观察细胞贴壁时间、细胞生长形态、原代生长周期。待细胞长到80%～90%时，用胰酶消化传代。

1.6 人输卵管妊娠绒毛滋养细胞的鉴定

将第4次传代的滋养细胞，计数板计数，以2×106个/mL的浓度接种于激光共聚焦皿中，24 h后，用PBS清洗，加入4%多聚甲醛，室温下固定15 min。PBS洗3次后，用0.1%曲拉通X-100增加细胞膜通透性，PBS洗涤细胞3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h;去血清后滴加1∶1混合的异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗人细胞角蛋白18（CK18）、荧光素（CY3）标记抗人波形蛋白各25 μL，4℃孵育过夜。次日取出后复温，用PBS重复洗涤细胞3次后滴加DAPI染核，避光室温下染色后加入PBS冲洗3次，激光共聚焦显微镜检测该体外培养的细胞角蛋白和波形蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 滋养细胞一般形态

原代培养滋养细胞接种后于倒置显微镜下可见大量圆形细胞悬浮存在，1 h后细胞开始慢慢贴壁，有个别细胞开始伸展，24 h后可明显见大部分细胞已经贴壁，48 h后大部分细胞伸展，到第9、10天细胞的数量明显变多，可见细胞呈扁平不规则的三角形或多边形，片状平铺生长，核较圆，胞质丰富，部分细胞连接成片，少量细胞呈长梭形。见图1。14 d长到80%～90%可传代，传代后3～4 d为1代。

2.2 人输卵管妊娠绒毛滋养细胞的鉴定

免疫荧光双标记检测结果显示：在细胞质中出现角蛋白和波形蛋白共表达的黄色部位。见图2（封四）。

3 讨论

目前，细胞体外培养的技术已成为研究滋养细胞相关疾病的重要手段，其关键步骤在于人滋养细胞体外分离的培养成功。妊娠期滋养细胞体外培养分为原代培养、分离纯化、传代培养和细胞鉴定4个阶段[2]。

本研究选取20～30岁女性，5～8周内早期输卵管妊娠患者。为提取活力较强的滋养细胞，应尽可能地选择青年女性[3]，以便提高滋养细胞体外培养的成功率。

取回胎盘组织后，用PBS缓冲液认真清洗，清除明显的血块及筋膜组织后，剪取绒毛，使其绒毛组织完全剪碎至糊状后进行消化分离。目前原代培养的分离方法主要分为组织块法和酶消化法2种[4]。组织贴块法操作简单，但原代细胞生长周期较长，需20 d左右，细胞纯度低且容易污染[5]，因此，该方法不建议用于滋养细胞的体外培养。胰蛋白酶消化法包括单一胰蛋白酶消化法和复合酶消化法，一般的酶消化法虽然能够快速地得到大量的细胞，但容易混入成纤维细胞且在反复消化细胞的同时对细胞的损伤比较大[6]，而胶原酶比较温和，还可以帮助分解间质细胞，但对上皮细胞影响不大[7]。故本研究选用胶原酶-胰酶混合消化法来消化细胞。

滋养层细胞的分离无论是采用组织块法或是酶消化法，细胞悬液里面都会含有血管内皮细胞、Hofbauer细胞、成纤维细胞及血细胞等[8]，故排除其他杂质细胞的污染是纯化滋养细胞的关键。因血管内皮细胞、Hofbauer细胞及血细胞等不属于贴壁细胞，多次换液中就可以去除。而成纤维细胞的贴壁能力较滋养细胞强，其具有先贴壁的特性，为提高其纯化度及分离细胞的简便，本研究采用差速贴壁法。也有很多研究者采用的是Percoll密度梯度分离法，其中，最为成熟的是Kliman等[9]发现的Percoll密度梯度分离法。Percoll本质上是一种经聚乙烯吡喀烷酮化学加工的硅胶颗粒，虽然其具有密度高、不穿透细胞、无毒害等特点[10]，但该方法操作繁琐、试剂消耗成本大，在普通实验室难以推广。

最后，所获得的细胞是不是滋养细胞还需要做细胞鉴定。本研究发现，该细胞在显微镜下呈不规则三角形或多边形，平铺整个视野，其生长形态与滋养细胞相吻合。但显微镜下细胞的一般形态描述不能用于细胞定性，细胞鉴定还需检测细胞骨架。目前滋养细胞的鉴定没有统一的标准，细胞角蛋白与波形蛋白的分析比较，是界内较为认可的鉴别方法[11]。波形蛋白是间质细胞的标志蛋白[12]，而细胞角蛋白，因其独特的细胞结构，是构成上皮细胞骨架的特有蛋白[13]。徐娟等[14]研究发现，滋养细胞只特异性表达细胞角蛋白。故可借此来辨别滋养细胞和间质细胞等其他细胞。

本研究采用了直接免疫荧光双标记染色法检测细胞中角蛋白和波形蛋白表达。结果显示，在细胞质中，存在CK18和波形蛋白共表达部位。近年来文献报道[15]显示，上皮细胞也可以表达波形蛋白，因此，波形蛋白表達阳性并不能否认该体外培养的细胞不是滋养细胞，有可能该细胞在体外培养的过程中，细胞性状发生了改变，向间质细胞方向转化了。近些年也有学者发现在一些滋养细胞中，也存在波形蛋白表达阳性[16-17]。但因文献时间较久，故此体外培养的滋养细胞未用于后期的实验研究。据文献报道[18]体外培养所得的原代细胞产量高，生长周期短，7 d左右可生长成片，本研究结果显示原代细胞经过14 d培养后才可进行初次传代，与文献报道略有出入。笔者分析其细胞活力、胰酶浓度、消化时间、实验室环境及操作人员均可能成为影响细胞生长的因素，均可能影响其研究结果，每一步骤掌控不好都有可能造成活细胞的变性。在分离纯化的过程中，有些组织和细胞耐受性较差，也会损害细胞的结构，从而影响细胞的生长时间或贴壁细胞变性[19-22]。因此在研究中需注意的一些问题：①取材患者的年龄越小，组织越新鲜，更容易增加培养成功率，获得数量更多更纯的滋养细胞[23]。②获取组织时，绒毛分支稠且送往实验室时间短，则培养时更易得到数量更多活力更好的细胞。③使用胰蛋白酶消化传代时，应注意胰酶的用量，而且消化时间不能太长，以免丧失部分细胞;其次，细胞传代应保持同等时间间隔。④胰蛋白酶应时用时配，新鲜胰蛋白酶消化细胞的能力强于配制时间长的胰蛋白酶。⑤滋养细胞贴壁时间较长，首次换液时间一般为16～24 h，以后常规换液时间最好不超过2 d，以免培养基营养成分耗尽造成细胞死亡。⑥绒毛组织越碎，细胞消化就会更加充分。

综上，结合显微镜和免疫荧光的结果，初步判定此体外培养的细胞可能为滋养细胞。如何获得数量丰富且纯度较高的滋养细胞仍是目前研究的热点，如能进一步研究出该细胞更多的生长特性和其他标志性的指标，将为各种滋养细胞相关疾病提供实验基础，为广大患者带来福音。

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（收稿日期：2020-01-08）