N-乙酰半胱氨酸对PM2.5诱导肥大细胞活化作用的影响

林志鹏 李锦濯 曾倩雯 黄显琼 孙仁山

陆军军医大学大坪医院皮肤科，重庆，400042

城市大气细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)主要来源于机动车尾气排放和工业生产等，其粒径≤2.5 μm，可长期悬浮于空气中，成分中富集的有机碳、无机碳、金属无机盐及多环芳烃等可引起一系列呼吸和心血管系统疾病，严重威胁人类健康[1]。近年发现，PM2.5能导致过敏性疾病如哮喘[2]、荨麻疹[3,4]等发病增加。大气PM2.5浓度每增高10 μg/m3，过敏性皮肤病如湿疹、特应性皮炎(AD)的发生危险增加0.52%[5]。肥大细胞(mast cell)是速发型超敏反应的核心[6]，外界过敏原如尘螨、颗粒物等可以激活肥大细胞表面的蛋白酶激活受体2(proteinase-activated receptor-2，PAR2)引起过敏炎症，促进组胺、胰蛋白酶和白细胞介素4(IL-4)等分泌[7,8]。实验发现PM2.5可以刺激肥大细胞(LAD2)脱颗粒释放组胺并生成活性氧(ROS)，引起细胞损伤和氧化应激反应[9]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是含有巯基(-SH)的抗氧化剂。研究表明NAC可显著抑制氧化应激与气道炎症，从而控制哮喘等发作，提示其具有良好的抗过敏作用[10]。本实验以NAC体外作用PM2.5诱导的肥大细胞脱颗粒模型，测定PAR2表达和β-氨基己糖苷酶(β-Hex)、IL-4释放水平，探索肥大细胞PAR2在NAC抗过敏中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 小鼠肥大细胞株(P815，中科院上海细胞库)。

1.2 试剂与设备 DMEM培养液(美国HyClone公司)；胎牛血清、青-链霉素(美国Gibco公司)；NAC、ROS检测试剂盒、CCK-8试剂盒(上海碧云天公司)；小鼠IL-4 ELISA 试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗小鼠IgG(北京索莱宝公司)；PAR2小鼠单克隆抗体、β-actin抗体、氨基己糖溶液(美国Sigma公司)；曲拉通 X-100溶液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液(上海生工生物公司)；CO2细胞培养箱，高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；冷冻干燥机(美国Labconco公司)；电泳仪、电泳槽和蛋白质含量测定仪(美国Bio-rad公司)；多功能酶标仪(美国MD公司)。

1.3 PM2.5的制备 PM2.5收集滤纸来自于重庆市九龙坡区卫生监督局下属检测站(图1)，采集期间(2018年10～12月)市区PM2.5日平均浓度[11]为48.88 μg/m3。改良Jin等[12]的方法提取PM2.5，步骤如下：将滤纸剪成1 cm×1 cm小块，浸于双蒸水中振荡60 min，过滤振荡液，12000 g冷冻离心5 min取上清，真空冷冻干燥48 h，钴-60辐照灭菌后，存放于-20℃。临用前溶于DMEM培养液，充分振荡，制成混悬液(10 mg/mL)。

图1 PM2.5采样点示意图

1.4 细胞模型建立及分组 采用PM2.5刺激肥大细胞脱颗粒建立模型。取对数生长期细胞，计数后接种于6孔板(浓度5×105个/mL)，同步处理24 h。设空白组、模型组、NAC高、中、低剂量组(浓度分为100、50、25 μmol/L)。空白组、模型组用等体积DMEM培养液代替受试药物NAC；NAC各剂量组加入不同质量浓度的药物，每个浓度设4个副孔。37℃，5% CO2条件下培养6 h，加入PM2.5混悬液，调节终浓度100 μg/mL(空白组加入等量DMEM培养液)，进行下述实验。

1.5 检测指标

1.5.1 细胞活力检测 PM2.5处理6、12 h后，采用CCK-8法分别检测各组细胞增殖情况。

1.5.2 ROS释放检测 PM2.5处理6、12 h后，细胞重悬于DCFH-DA(10 μmol/L)荧光探针中，避光培养30 min，PBS缓冲液洗涤3次后，吸取200 μL 接种96孔板，酶标仪测定488 nm激发波长，525 nm发射波长下的荧光值。

1.5.3 β-Hex释放率测定 PM2.5处理6 h后，吸取50 μL上清于96孔板，加入50 μL氨基己糖底物(1 mmol/L)；总酶组中加入500 μL 1% 曲拉通X-100裂解细胞后，吸取50 μL上清于96孔板，加入50 μL等量氨基己糖底物；于37℃培养2 h，加入100 μL终止液(200 mmol/L pH 10.7甘氨酸缓冲液)后，酶标仪检测410 nm光密度OD值。以PM2.5实验组β-Hex释放量与曲拉通组裂解细胞后总β-Hex释放量之比，衡量PM2.5刺激细胞后的β-Hex释放率。β-Hex释放率(%)=[(OD实验-OD空白)/(OD总酶-OD空白)]×100%。

1.5.4 IL-4分泌量检测 PM2.5处理6 h后，取500 μL细胞培养液，500 g离心5 min，取上清。按小鼠IL-4 ELISA试剂盒说明检测IL-4浓度。

1.5.5 PAR2蛋白检测 PM2.5处理6 h后，裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定细胞样品蛋白浓度，每孔取蛋白20 μg，进行12% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜、在5%脱脂奶粉-TBST室温封闭2 h，分别加入PAR2抗体(1∶1000稀释)与β-actin抗体(1∶5000稀释)，4℃过夜。加入二抗(1∶5000稀释)，37℃反应1 h，用TBST洗涤3次，每次15 min。采用Western blot印迹法进行蛋白检测，以目的蛋白条带与内参β-actin的灰度值之比作为蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni检验，数据以均数±标准差表示。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖活性比较 模型组细胞存活率均显著低于空白组与中、高剂量NAC组(P<0.05)，见表1。说明NAC可能改善PM2.5对肥大细胞增殖活性的损害，提升存活率。

表1 各组细胞存活率比较 %

2.2 各组ROS生成比较 PM2.5刺激6 h后，模型组ROS生成量显著高于空白组与中、高剂量 NAC组(P<0.05)；PM2.5刺激12 h后，模型组ROS生成量显著高于空白组与各NAC浓度组(P<0.05)，低剂量组ROS显著高于高剂量组(P<0.05)，见表2。说明NAC可能抑制肥大细胞ROS，浓度越高，抑制作用越强。

表2 各组ROS生成比较

2.3 各组β-Hex释放率比较 模型组β-Hex释放率高于空白组(P<0.05)；各NAC浓度组均能抑制β-Hex释放，而高剂量组释放率显著低于其他各组(P<0.05)，见表3。说明NAC可能抑制肥大细胞活化释放β-Hex，且浓度越高，抑制作用越强。

2.4 各组IL-4分泌量比较 模型组IL-4分泌高于空白组(P<0.05)；各NAC浓度组均能减少IL-4分泌，且高剂量组抑制作用强于模型组与低剂量组(P<0.05)，见表3。说明高剂量NAC可能降低肥大细胞IL-4的分泌。

表3 各组β-Hex释放率、IL-4分泌比较

2.5 各组PAR2蛋白表达比较 模型组与空白组比较，PAR2蛋白表达量显著增高(P<0.05)；各NAC浓度组PAR2蛋白表达量较模型组显著降低(P<0.05)，低剂量组表达量高于中、高剂量组(P<0.05)，见图2。说明NAC可能抑制PAR2蛋白表达。

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05

3 讨论

近年来，我国城市PM2.5污染程度仍在加重，尤其是冬季雾霾，除了危害呼吸、心血管及神经系统，增加健康负担，更是各类过敏性疾病发病率迅速增加的重要原因。作为各型超敏反应的核心，肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒可以释放组胺、类胰蛋白酶、白三烯(LTs)、白介素(IL)及肿瘤坏死因子(TNF-α)等I型超敏反应介质[13]，诱发肥大细胞“细胞因子瀑布”，加剧过敏炎症反应[6，14]。早期研究指出，蛋白酶激活受体2(PAR2)在过敏性炎症的病理过程中起到重要作用[15]。Li等[16]证实尘螨可通过PAR2受体激活气道上皮细胞，促进IL-6、IL-8和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子和趋化因子的分泌。除此之外，PM2.5能够提高细胞氧化应激反应，影响NF-κB、ASK1-JNK及p53等胞内信号通路，上调炎性因子基因转录及蛋白表达[17]，也可直接激活氧化钙调蛋白激酶(Ox-CaMKII)，启动脱颗粒，引发过敏性疾病[18]。故探索PM2.5诱发过敏性疾病的防治措施具有重要的价值和意义。

NAC是左旋精氨酸的衍生物，具有多种药理活性，能够调节细胞代谢，清除体内氧自由基，有效抑制氧化应激反应[19]，已广泛用于临床治疗。李剑等[20]发现NAC可降低哮喘患者TNF-α、IL-6，改善呼吸峰值流量(PEF)，起到控制气道炎症效果。NAC联合糖皮质激素能调节重度哮喘患者TNF-α和IL-8水平，改善肺功能[21]。已有文献报道，IL-29可上调肥大细胞PAR-2表达并增加IL-4分泌，而使用阻断抗体AG490或LY294002后肥大细胞IL-4释放水平降低[22]。此外，PAR-2受体的激活，可促进肥大细胞(P815)分泌Th2 细胞因子IL-4，从而调控 IgE 合成型 B 细胞的转化，参与过敏性炎症反应[7]。本实验结果表明，NAC能够提高PM2.5体外刺激肥大细胞后的细胞存活率，调节ROS生成，阻断PAR2蛋白的表达，抑制脱颗粒释放β-Hex和IL-4。提示NAC可能减轻PM2.5对肥大细胞的损伤，抑制其活化脱颗粒。

肥大细胞是荨麻疹的主要效应细胞，研究发现皮肤风团周围的真皮组织肥大细胞发生活化、脱颗粒并释放局部炎性细胞因子和神经肽等，诱导Th2型炎症[23]。此外，PAR2受体可影响肥大细胞活化，改变皮肤细胞和感觉神经间的联系，在皮肤神经性炎症发展中起重要作用[24]。在小鼠皮炎模型中，应用PAR2受体抑制剂PZ-235可抑制肥大细胞IL-4分泌，缓解皮肤瘙痒症状，对AD有良好疗效[25]。Kim等[26]研究提示抗氧化剂NAC可以抑制支气管上皮细胞(A549)内胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和ROS水平，改善PAR2介导的过敏性炎症，降低支气管高反应性。传统医学研究还发现中药 “防风”能通过阻断PAR2受体，降低IL-6与组胺分泌，调节肥大细胞功能起到抗过敏作用[27]，这与本研究结果相似。同时，近年还发现其它抗氧化剂如维生素E[28]、Trametes Orientalis多糖[29]、橘红[30]等也具有抗过敏及免疫调节作用，能够减轻PM2.5导致的肺部氧化应激和炎症损伤。实验初步发现，NAC对肥大细胞活化具有一定的保护作用，但对PAR2受体的具体作用途径仍不明确，有待利用PAR2阻断剂做进一步研究。

综上所述，NAC可能通过抑制PAR2表达，调节PM2.5诱导的肥大细胞活化，减少相关细胞因子和炎症介质的分泌，达到抗过敏的作用，从而进一步为药物防治PM2.5诱发过敏疾病提供新思路。