授精时机对38岁及以下患者IVF-ET临床结局的影响

董娟，马龙，夏梦，孟慧，张园，蔡令波，刘嘉茵

(南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心，南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京 210029)

控制性促排卵是人类辅助生殖助孕过程中的一个关键环节，其目的是促进多个卵泡发育，获得数量适当的成熟卵母细胞，进而获得数量可观的可用胚胎，从而提高妊娠率。在促排卵过程中，常规使用促性腺激素释放激素激动剂进行垂体降调节或使用促性腺激素释放激素拮抗剂来直接抑制LH 峰，因此必须使用外源性绒毛膜促性腺激素来促进卵泡的最后成熟和卵子减数分裂的恢复，我们把这个过程俗称扳机[1]，扳机最常用的外源性激素是HCG。

目前常规取卵时间为HCG注射后36 h，但HCG注射后授精时间尚无统一意见。有研究认为，常规体外受精的最佳授精时间在HCG注射后40～41 h，因为此时间段的临床妊娠率较高、早期流产率较低[2]。还有研究表明，卵子体外培养2～7 h甚至更长时间(HCG注射后35～45 h)行ICSI授精，临床妊娠率无明显差异[3-4]。有研究者认为，ICSI周期中成熟卵母细胞最合适的孵育时间是5～6 h，此时具有较高的胚胎质量和临床妊娠率[5]。本文采取回顾性分析的方法，探讨HCG注射后不同授精时机对IVF-ET临床结局的影响。

材料与方法

一、研究对象及分组

本研究数据来源于南京医科大学第一附属医院临床生殖医学管理系统数据库(CCRM)，检索并回顾性分析2014年1月至2019年4月进行的IVF-ET助孕周期，均采用长方案和拮抗剂方案促排卵。纳入标准：(1)女方因盆腔输卵管因素不孕；(2)女方年龄≤38岁；(3)获卵数在3～20枚之间；(4)夫妇双方染色体正常；(5)男方精液各项指标符合常规IVF标准；(6)第一周期促排卵；(7)行卵裂期胚胎移植。

最终有2 878个周期纳入分析。根据HCG注射后授精时机的不同分为三组。A组：HCG注射后38～39 h(含38 h)授精(n=404)；B组：HCG注射后39～<40 h(含39 h)授精(n=1 293)；C组：HCG注射后40～<41 h(含40 h)授精(n=1 181)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用长方案和拮抗剂方案促排卵[6]。(1)卵泡期长方案：月经周期第1～2天，阴道B 超监测并记录窦卵泡个数及大小，无直径>10 mm卵泡时予长效GnRH-a(达菲林，益普生，法国)3.75 mg肌注，30～35 d后行性激素及B超检查，FSH达到3.0 U/L左右后给予重组人卵泡刺激素(r-FSH，果纳芬，默克雪兰诺，德国)促进卵泡发育，根据性激素及B超情况调整Gn用量；当直径≥18 mm卵泡数占直径≥14 mm卵泡数的50%时，停止使用Gn，肌注HCG(珠海丽珠医药)6 500 U，注射后36 h取卵。(2)拮抗剂方案：于月经周期第3天，阴道B超监测并记录窦卵泡个数及大小，无直径>10 mm卵泡时开始Gn促排卵，以果纳芬100～225 U和(或)注射用尿促性素(HMG，乐宝得，珠海丽珠医药)75 U启动；Gn应用4～5 d后经性激素及B超检查，在优势卵泡直径≥12～13 mm或雌激素达3 000 pmol/L时开始注射醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺，德国)0.25 mg/d至HCG日。HCG注射及取卵时间同卵泡期长方案。

2.体外授精和胚胎培养：按照本中心常规流程，HCG注射后36 h采用经阴道后穹隆穿刺法获取卵母细胞。获取的卵泡抽吸液在体视显微镜下收集卵丘卵母细胞复合物，于IVF液(Fertilization Medium，COOK，美国)中培养；取卵当日男方手淫法采取精液，液化后的精液经密度梯度离心法结合上游法获得有效精子，精子质量符合IVF授精要求。取卵获得的卵子至少培养2 h后进行IVF授精，精子浓度为3～5×105/ml。授精后4 h拆除颗粒细胞，将卵子转移至卵裂培养液(Cleavage Medium，COOK，美国)中，授精后18 h左右观察受精情况，出现双原核的为正常受精，授精后第3天进行卵裂期胚胎发育评估。

3.胚胎评分和胚胎移植：卵裂期胚胎评分方法参照文献[7-8]。在400倍倒置显微镜下，根据卵裂球数目、形态和碎片情况对第3天胚胎进行评分，具体分为Ⅰ～IV级。评分为Ⅰ级和Ⅱ级的为优质胚胎，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎为可移植胚胎。根据第3天胚胎评分和患者雌激素水平及内膜厚度，选择1～2枚胚胎进行移植，移植后常规黄体支持。对于移植后有剩余胚胎的患者，经其知情同意后行囊胚培养或胚胎冷冻。

4.临床结局判断：移植后14 d检测血β-HCG，若β-HCG值为阳性则移植后30 d行超声检查，超声下见孕囊及胎心管搏动判定为临床妊娠。妊娠12周内发生胚停或妊娠物排出诊断为早期流产。妊娠满28周且至少有1个存活新生儿分娩判定为活产。

三、统计学分析

结 果

一、三组患者基本临床资料比较

三组患者间平均年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础FSH、抗苗勒管激素(AMH)等基础指标比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组患者基本临床资料比较(-±s)

二、三组患者的实验室指标比较

三组患者间正常受精率有显著性差异，且随着授精时间的延迟，正常受精率逐渐提高(P<0.05)；C组的多精受精率显著低于A组和B组(P<0.05)；三组间卵裂率和优质胚胎率均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

三、三组患者移植周期的临床结局比较

三组患者间临床妊娠率、胚胎种植率、流产率以及每移植周期活产率比较均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表2 三组患者实验室结局比较[(-±s)，%]

表3 三组患者的临床结局比较(%)

讨 论

当前，辅助生殖技术的最终目标已由最初的追求成功妊娠转变成希望患者拥有一个活产的健康的婴儿，本研究对HCG注射后不同时间行IVF授精的临床结局包括每移植周期活产率进行了比较研究。结果提示，在一定时间范围内(38～41 h)，对于38岁及以下接受常规促排卵行IVF-ET的患者，HCG注射后的不同时间授精并不影响IVF-ET的临床结局。

早期的IVF-ET技术是在自然周期进行，获卵数及可供移植的胚胎少，成功率相对低。控制性促排卵的应用改善了IVF-ET的临床妊娠率，对提高成功率和促进辅助生殖衍生技术的发展发挥了重要作用[6]。生理条件下，卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟，两者精确同步并且相互协调，是卵母细胞正常受精和胚胎进一步发育的保障。但是控制性促排卵获得的同一批卵母细胞成熟状态并非一致。有研究认为促排卵获得的卵母细胞中有15%处于第一次减数分裂中期和生发泡(GV)期[9]。不少研究认为取卵后卵母细胞在体外的孵育时间会影响卵母细胞的成熟、受精及胚胎发育潜能[10-11]。若IVF授精过早，有一部分卵母细胞仍处于未成熟状态，或者有部分卵母细胞核质未成熟，纺锤体等细胞器的结构及功能异常，易导致受精率低且胚胎发育潜能低下[12]。若授精过晚，卵母细胞可能老化，纺锤体结构异常比率升高，可能会导致卵母细胞染色体结构异常，进而影响受精率和胚胎质量。

目前有不少有关HCG注射后IVF或ICSI授精时机的研究，但是最佳授精时机尚无定论。对于ICSI授精来说，大多数研究的总体建议是在37～42 h之间进行ICSI授精，可以获得理想的实验室和临床结局[13-17]。陈威等[18]的报道称采用固定方案患者的ICSI周期中，授精时机在38～43 h的窗口期均能达到比较一致的胚胎质量及临床妊娠率。然而对于IVF授精时机的研究并不是很多。有研究认为HCG注射后授精时间间隔对受精率、卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率及临床结局没有明显影响[4，19]。但蔡慧中等[2]认为最佳授精时间为HCG注射后40～41 h，认为此时授精的患者有较高的临床妊娠率和较低的早期流产率。对HCG注射后不同时间授精所得到的研究结论并非一致，而且只是停留在实验室或早期妊娠阶段，并未对后续活产情况进行追踪报道。

有研究认为，在促排卵过程中，当卵泡大小发育到一定直径后，卵泡内颗粒细胞和卵泡膜细胞有足够的LH受体，成熟卵泡的排出将在HCG注射后38～40 h发生[20-21]。根据我中心临床工作的时间安排，本研究将IVF授精时间段设定在HCG 注射后38～41 h。通过研究发现，随着HCG注射后授精时间的延长，正常受精率显著增加而多精受精率显著降低。说明HCG注射后，在一定时间范围内适当延长授精的时间，可以改善受精情况。考虑可能原因是促排卵获得的部分卵母细胞核质不同步，延长其体外培养时间有利于卵母细胞核质成熟的同步性，从而提高卵母细胞的质量及成熟度并最终提高正常受精率，降低多精受精率。本研究中不同授精时间三组的卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎种植率以及早期流产率均无统计学差异，这与吴竺等[4]的研究结果相似。本研究还对患者后续的活产情况进行了追踪随访，发现三组间的每移植周期活产率也无统计学差异。

本研究报道了HCG注射后不同时机授精对活产率的影响，对临床工作有一定的指导意义。不足之处在于未对两种促排卵方案进行区分比较，亦未加入冻融胚胎移植周期细分研究。有研究认为在授精时机的选择上也要根据卵母细胞的成熟度和质量来决定[22]。因此，在将来的研究中，应加大样本量并进行细致分组，综合促排卵方案、患者年龄、卵母细胞的成熟度和质量等因素进行更全面地分析，以期为临床提供更准确的参考数据，更好地提高IVF-ET助孕的临床结局。

综上，本研究结论提示，在一定时间范围内(38～41 h)，HCG注射后的授精时机并不影响38岁及以下患者的IVF-ET临床结局。在此时间范围内适当延迟授精时机，可以提高正常受精率，降低多精受精率。