不同来源冷冻复苏精子ICSI后对囊胚培养结局的影响

钟惠娴，陈培林，熊风，万才云，姚志鸿，曾勇，孙青*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳 518045；2. 深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳 518045)

卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)广泛地应用于男性不育的治疗。用于ICSI的精子有手淫射出精子、显微外科手术获得的精子，其中显微外科手术精子有经皮附睾精子抽吸术(PESA)和睾丸精子抽吸术(TESA)获得的精子等。随着技术的发展，不同精子来源以及冷冻对ICSI结局的影响受到人们的日益关注[1-4]。囊胚培养技术是人类辅助生殖技术中重要的一部分，它通过延长胚胎体外培养时间，能够有效淘汰部分发育潜能低下或基因缺陷的胚胎，筛选出发育潜能更高的胚胎。但是，不同来源冷冻复苏精子ICSI后对囊胚培养结局的影响尚不清楚。本研究回顾性分析了2013年7月至2019年1月在本中心使用冷冻复苏精子行ICSI治疗的不孕不育患者的临床资料，对比分析手淫或手术(PESA及TESA)获得精子冷冻复苏行ICSI治疗后胚胎的发育结局，包括囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率，旨在为临床制定个体化囊胚培养策略提供理论依据。

材料与方法

一、研究对象

回顾性分析2013年7月至2019年1月在本中心使用冷冻复苏精子行ICSI治疗的不孕不育患者的临床资料。纳入标准：(1)女方年龄≤40 岁；(2)常规促排卵方案；(3)行囊胚培养的胚胎数>0。排除行PGT-M或PGT-A的周期。

共纳入269个治疗周期。根据冷冻复苏精子来源不同分为手淫组(94个周期)和手术组(175个周期)，而手术组根据手术位置不同又分为两个亚组：PESA组(82个周期)和TESA组(93个周期)。

二、方法

1.控制性促排卵及卵母细胞收集：根据患者的卵巢储备和反应情况，采取相应的促排卵方案。当有两个或以上卵泡直径≥18 mm的优势卵泡时，肌肉注射10 000 U的HCG(珠海丽珠制药)，注射34～36 h后行阴道B超穿刺负压抽吸取卵，卵母细胞放入受精培养液(SAGE，美国)中直至授精。

2.精液处理及冷冻复苏：(1)精液处理：因取精困难、出差等特殊原因导致在取卵日无法提供精液，或因手术取精后避免反复手术带来创伤的患者，通过提前冷冻精子至取卵日复苏使用。手淫取精患者，在禁欲2～7 d后，手淫取精后使用Quinn’s 2040和2080(SAGE，美国)进行密度梯度离心法处理精液并冷冻精子；行PESA或TESA取精时，若在显微镜20个高倍视野下观察到活动精子则进行精子冷冻。(2)精子冷冻及复苏：精子悬液与精子冷冻保护剂(SAGE，美国)按体积1∶1在冷冻管中混匀，室温静置10 min，在液氮罐中利用液氮蒸汽熏蒸15 min后投入液氮冷冻保存。取卵日复苏精子，精子冷冻管在37℃培养箱放置15 min后，将精子冷冻混合液加入到受精培养液中离心，去上清后保留少量液体于离心管中。处理后在显微镜下观察，若有活动精子则行ICSI。

3.配子受精及胚胎移植和冷冻：各周期均采用ICSI授精方式。授精后24 h、48 h、72 h观察卵裂情况及胚胎发育情况。授精72 h(Day 3)后对胚胎进行评分评级[5]。优质胚胎：卵裂球数目≥7个、碎片≤10%的 Ⅰ级胚胎，以及卵裂球数目≥7个、碎片>10%且≤20%的Ⅱ级胚胎。根据患者个体情况及Day 3胚胎的数量和质量，Day 3卵裂胚胎有以下2种处理途径：(1)在Day 3进行新鲜胚胎移植或胚胎冷冻后剩余胚胎行囊胚培养；(2)所有胚胎行囊胚培养。

4.囊胚培养：将2～3个胚胎转移至囊胚培养液滴(SAGE，美国)中培养至Day 5～7，观察囊胚形成情况。按照Gardner等[6]囊胚分级法对形成的囊胚进行评分，内细胞团和滋养层细胞评分均高于C的囊胚为优质囊胚；只要内细胞团或滋养层细胞其中之一的评分高于C的囊胚则为可利用囊胚；内细胞团和滋养层细胞评分均为C则为非优质囊胚。

5.观察指标：MⅡ卵率=MⅡ卵数/获卵数×100%；ICSI受精率=(1PN卵数+2PN卵数+多PN卵数+晚期卵裂数)/注射MⅡ卵数×100%；卵裂率=卵裂胚胎数/受精卵母细胞数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=囊胚形成数/胚胎培养数×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚数/囊胚形成数×100%；优质囊胚率=优质囊胚数/囊胚形成数×100%；继续培养优质胚胎占比=继续培养优质胚胎数/胚胎培养数×100%。以上指标在每个周期均进行计算。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

本研究共纳入269个取卵周期，根据冷冻复苏精子的来源不同分为手术组(n=175)和手淫组(n=94)；手术组由PESA组(n=82)和TESA组(n=93)2个亚组组成。

手淫组与手术组比较，组间女方年龄、平均获卵数、MⅡ卵率、受精率、卵裂率差异均有统计学意义(P<0.05)；而两组间体重指数(BMI)、不孕年限、优质胚胎率及继续培养优质胚胎率差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

TESA组与PESA组比较，女方年龄、BMI指数、平均获卵数、MⅡ卵率、受精率、优质胚胎率及和继续培养优质胚胎率差异均无统计学意义(P>0.05)；组间不孕年限、卵裂率差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 一般资料比较(-±s)

二、不同来源冷冻复苏精子的囊胚培养比较

TESA组和PESA组的囊胚培养数、囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率均无统计学差异(P>0.05)。手淫组的囊胚培养数显著低于手术组(P<0.05)，而两组间囊胚形成率、可利用囊胚率及优质囊胚率均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同来源冷冻复苏精子的囊胚培养情况比较(-±s)

三、不同来源精子对囊胚培养结局的影响分析

多重线性回归分析手淫和手术冷冻复苏精子ICSI后对囊胚形成率、可利用囊胚率及优质囊胚率的影响。分别以囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率为因变量，不同冷冻复苏精子来源(手术vs.手淫)为二分类自变量，同时矫正一元线性回归分析中P≤0.2的因素(表3)。结果显示，手术组的囊胚形成率显著低于手淫组(P<0.05)，而可利用囊胚率和优质囊胚率差异均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表3 影响囊胚培养因素的一元线性回归分析

表4 多重线性回归分析不同冷冻复苏精子ICSI后对囊胚培养结局的影响

讨 论

本研究根据不同来源冷冻复苏精子进行分组比较，观察不同来源精子ICSI后对胚胎囊胚培养结局的影响。研究结果显示，手术取精中，PESA和TESA冷冻复苏精子ICSI受精后，胚胎囊胚培养结局差异无统计学意义。手术和手淫冷冻复苏精子ICSI后，多重线性回归分析结果显示，手术组的囊胚形成率显著低于手淫组，而两组间可利用囊胚率及优质囊胚率差异无统计学意义。提示手术来源的精子冷冻复苏影响ICSI后胚胎继续培养的囊胚形成，但不影响可利用囊胚及优质囊胚的形成。

为治疗无精子症患者，临床上通过显微外科手术获得附睾或睾丸精子，结合ICSI技术能够为无精子症患者孕育后代带来可能性。同时使用冷冻技术进行精子冷冻能够保存男性生育力，减少了患者因反复手术带来的并发症。有研究认为，附睾精子的DNA损伤程度显著高于睾丸精子，所以使用睾丸精子后胚胎的囊胚形成率要显著高于附睾精子的[7]。另有研究报道睾丸精子染色质DNA断裂水平明显高于附睾精子，这可能影响胚胎进一步的发育[8]。目前使用冷冻复苏附睾或睾丸精子进行ICSI后，更多的是研究胚胎早期卵裂胚情况及妊娠结局[9-11]，对胚胎行囊胚培养结局的影响尚未进行研究。本研究结果显示，冷冻复苏的睾丸和附睾精子ICSI后胚胎继续培养的囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率差异无统计学意义。结果提示，临床上冻融睾丸和附睾精子行ICSI治疗后，胚胎具有相似的发育潜能。

精子从体内到体外，经历了一系列的成熟过程。不同阶段的精子，其成熟度、DNA损伤程度、畸形率、染色体异常比例等存在一些差异[12]，可能影响早期胚胎发育和胚胎发育潜能[13-14]。目前，一些研究比较了不同来源新鲜精子ICSI后囊胚培养结局，但不同来源新鲜精子是否影响ICSI后囊胚形成仍然存在争议。有研究显示，新鲜射出精子和附睾精子ICSI后胚胎的囊胚培养结局无显著性差异[15]。郑炜炜等[16]研究指出，新鲜射出精子、睾丸和附睾精子ICSI后组间的囊胚形成率无统计学差异，但睾丸精子与附睾精子的可利用囊胚率显著高于射出精子。也有学者认为，不同来源的新鲜精子(射出精子、睾丸和附睾精子)对低质胚胎的发育潜能无显著影响[3]。另外，Balaban等[17]研究显示，新鲜射出精子的囊胚形成率显著高于非梗阻性睾丸精子。有研究表明，冷冻复苏技术对精子的DNA完整性等有影响[18-19]，虽不影响卵母细胞的受精，但冷冻复苏后精子DNA损伤显著提高[20]，当损伤程度较高导致卵母细胞无法修复时，可能引起囊胚形成障碍[14，21-23]。本研究结果提示，手术来源的精子冷冻复苏ICSI后影响胚胎的囊胚形成，但不影响胚胎的可利用囊胚及优质囊胚的形成。虽然新鲜睾丸和附睾精子的DNA损伤低于射出精子[24]，但冷冻复苏对不同来源精子的DNA损伤程度是不清楚的；此外睾丸精子畸形率、染色体异常比例高于射出精子[25]，且手淫组可供选择的精子较多，挑选到质量好的精子的概率更大。这些都可能导致手术来源精子冷冻复苏行ICSI的囊胚形成率低于手淫来源精子。

综上所述，临床上冻融睾丸和附睾精子行ICSI治疗后，胚胎具有相似的发育潜能。此外，手术来源的精子冷冻复苏ICSI后影响胚胎的囊胚形成，但不影响胚胎的可利用囊胚及优质囊胚的形成。所以，实验室可根据患者的不同情况，选择不同的冷冻复苏精子进行ICSI治疗，同时可以根据不同来源冷冻复苏精子制定不同的选择性囊胚培养方案。