层黏连蛋白α2缺陷型先天性肌营养不良的临床与基因分析

何展文 柏 萍 李平甘 吴若豪 陈启慧 李 宇 罗向阳

中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120

先天性肌营养不良(congenital muscular dystrophy，CMD)是一组自出生时或生后数月内起病的罕见的原发性和进行性肌病，具有临床和遗传异质性，主要临床表现为婴儿早期出现肌无力、运动发育迟缓、肌张力低下等[1]。层黏连蛋白α2缺陷型先天性肌营养不良(LAMA2-MD)是CMD最常见的亚型，占所有CMD的1/3，LAMA2-MD与编码层黏连蛋白2(laminin2)的3个亚单位之一α2链(LAMA2，也称Merosin)基因缺陷有关[2-3]。肌肉活检及LAMA2基因检测可明确其诊断，但至今国内基因明确病例并不多见。本研究回顾2010-10—2018-09中山大学孙逸仙纪念医院确诊3例LAMA2-MD的临床特点和基因结果，探讨临床表现以及基因检测对诊断的作用。

1 资料与方法

1．1诊断标准LAMA2-MD诊断主要根据临床表现和实验室检查，主要临床表现包括出生时至婴儿早期出现肌无力、肌张力减低，运动发育落后，关节挛缩，智力多正常，血清肌酸激酶水平增高。确诊经肌肉活检病理和基因检测，肌肉病理免疫组化染色提示Merosin完全缺失或部分表达，或基因检测到两个致病性等位LAMA2基因突变[3]。

1．2研究方法

1．2．1 头颅影像学检查：采用Philips Intera 1.5 T超导MR仪，仰卧位，行头颅平扫和增强检查，常规SE序列T1WI(TR 450 ms，TE 15 ms)成像，T2WI(TR 2 000 ms，TE 120 ms)成像，层厚5 mm，间隔0.5 mm，矩阵256×256，FOV 230 mm×230 mm，采用Gd-DTPA(剂量0.2 mL/kg体质量)对比剂，分别行横轴位和冠状位、矢状位检查。

1．2．2 肌肉病理：首先向患儿家属交代病情和手术相关事项，签署同意书。选择小腿腓肠肌行开放性活检。肌肉标本分成两部分，一部分经异戊烷预冷后放入液氮中固定，冰冻切片，切片厚度8 μm。分别进行组织学和组织化学方法染色，包括苏木精-伊红(HE)染色、改良 Gomori三色(MGT)染色、还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶(NADH-TR)染色、高碘酸 Schiff反应(PAS)染色、油红O染色、琥珀酸脱氢酶(SDH)染色、细胞色素C氧化酶(COX)和染色SDH/COX双染。另一部分肌肉在2%戊二醛中固定，1%锇酸后固定，常规脱水和塑料包埋，超薄切片，铅铀双染色，电镜下观察。

1．2．3 肌肉标本免疫组化：单克隆一抗包括抗萎缩蛋白(Dystrophin)-Rod、Dystrophin-C、Dystrophin-N、Dysferlin、α/β/γ/δ-肌聚糖(sarcoglycan)、层黏连蛋白(Merosin)及胶原蛋白Ⅵ(Collagen Ⅵ)抗体，免疫组织化学染色采用链霉卵白素-生物素法染色试剂盒。

1．2．4 致病基因检测：收集患儿及父母外周血标本，提取DNA，二代基因测序检测遗传性肌营养不良基因，多重链接探针扩增技术(MLPA)检测LAMA2基因缺失或重复。

2 结果

2．1临床表现确诊层黏连蛋白α2链缺陷型先天性肌营养不良患儿共3例(表1)，男2例，女1例。所有患儿均为生后起病，表现为运动里程碑落后，近端肌无力为主，肌张力低下。例2能独走，但走路不稳，上楼梯困难，其余2例患儿最大运动能力为独坐。语言发育与智力均正常。3例患儿营养状态不良，体质量低下。例1有脊柱侧弯，例1和例3有关节挛缩(肩、肘、膝和踝关节)。血清肌酸激酶(CK)中度升高(895～1 414 U/L)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)轻中度升高(34～94 U/L)。所有患儿行心电图检查均无异常。

表1 3例层黏连蛋白α2链缺陷型先天性肌营养不良患儿的临床特点Table 1 Clinical characteristics in 3 patients with LAMA2-MD

2．2脑电图与头颅磁共振检查所有患儿行脑电图及头颅MRI检查。3例患儿脑电图检查示正常小儿脑电图。3例患儿头颅MRI检查均示双侧大脑半球白质区对称多发斑片状、片状异常信号灶，T1WI上呈稍低信号(图1A)，T2WI上呈高信号(图1B)，FLAIR上呈高信号(图1C)，增强未见明显强化(图1D)；内囊、胼胝体、基底节、丘脑、小脑及脑干均无受累，侧脑室、第三、第四脑室形态、信号未见异常。

2．3肌电图、肌肉病理及免疫组织化学检查全部病例行肌电图检查，肌电图检查均提示肌源性损害，表现为周围神经运动传导波幅低，时限缩短。病例2和病例3进行肌肉组织病理检查。肌肉病理组织学HE染色显示肌纤维大小不等，可见散在分布少许坏死伴吞噬纤维及再生纤维；可见较多高收缩纤维，未见内核纤维增多；肌间质未见炎细胞浸润，肌间及肌内膜结缔组织明显增生(图2A)。电镜检查示部分肌纤维内肌原纤维排列紊乱，局部见灶状肌溶灶及萎缩肌纤维，局部脂质空泡增多、糖原未见增多，未见杆状体改变，未见异常管聚集现象；未见异常线粒体堆积，肌间质胶原纤维增生，未见炎细胞浸润，毛细血管基底膜未见明显增厚(图2B)。病例2免疫组织化学染色显示Merosin部分肌纤维膜表达减弱，局灶缺失(图2C)；病例3免疫组织化学染色显示Merosin表达明显减弱或缺失(图2D)。Dystrophin-Rod/C/N、Dysferlin、Collagen Ⅵ和α/β/γ/δ-sarcoglycan均完全正常，表达连续、均匀。

图1 层黏连蛋白α2链缺陷型先天性肌营养不良患儿头颅MRI表现，脑实质结构对称，脑室不大，双侧大脑半球白质信号异常，A：T1WI上呈稍低信号(冠状位)；B：T2WI上呈高信号(横断位)；C：FLAIR上呈高信号(冠状位)；D：增强未见明显强化(横断位)Figure 1 Skull MRI manifestations in patients with LAMA2-MD.The parenchymal structure of the brain is symmetrical，the ventricles are small，and the white matter signals of the cerebral hemispheres are abnormal.A：Slightly low signal on T1WI (Coronal position)；B：High signal on T2WI (Transverse position)；C：High signal on FLAIR (Coronal position)；D：No obvious enhancement in enhancement (Transverse position)

2．4基因检测病例1检测到LAMA2基因(NM_000426.3)1个杂合变异为50号外显子区域c.7147 C>T杂合突变，该突变为无义突变(p.Arg2383*)，导致编码产物氨基酸序列提前终止，该突变来自于其父亲；另一突变为46号外显子区域c.6513_6515微缺失突变，引起所编码的蛋白质第2172位的氨基酸残基Val缺失，该突变来自于其母亲；此复合突变为已报道的致病突变。病例2检测到LAMA2基因(NM_000426.3)2个杂合变异，一个为46号外显子区域c.6513_6515微缺失突变，引起所编码的蛋白质第2172位的氨基酸残基Val缺失，该突变来自于其母亲；另一突变为17号内含子区域发生杂合突变c.2451-6A>G；p.?，该突变来自于其父亲，为国际上尚未报道的新发突变，未知意义。应用MLPA技术对LAMA2基因分别进行检测结果未见异常。病例3检测到LAMA2基因(NM_000426.3)2个杂合变异，一个为46号外显子区域c.7810C>T杂合突变，为无义突变(p.Arg2604*)，导致编码产物氨基酸序列提前终止，该突变来自于其母亲，此突变为既往报道的致病突变；另一突变为24号内含子区域发生杂合突变c.3556-13T>A，该突变产生一个新的剪接受体位点，引起编码产物氨基酸序列提前终止，来自于其父亲。应用MLPA技术对LAMA2基因分别进行检测结果未见异常。

3 讨论

LAMA2-MD又称Merosin缺陷型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)，是一种常染色体隐性遗传性肌营养不良，是最常见的先天性肌营养不良(CMD)，全球患病率(1～9)/10万人，欧美国家多见，在先天性肌营养不良中约占1/3[2，4-8]。LAMA2-MD发病的主要机制是肌肉层黏连蛋白α2的完全或部分缺乏。当层黏连蛋白α2有缺陷或缺失时，肌肉纤维受到机械应力，容易撕裂和断裂，导致组织损伤和变性[9]。LAMA2-MD其特征是出生时或出生后6个月内发病，表现为严重的肌无力和肌张力低下，以近段肌力低下为主，面肌受累出现吮吸无力，部分出现关节挛缩[10-15]。大多数患儿的运动发育里程碑延迟，2～3岁时会独坐，很少有人获得独立的行走[16]。LAMA2-MD的临床表现取决于层黏连蛋白α2缺乏的程度。层黏连蛋白-α2的完全缺失表现为严重的早发性CMD，而层黏连蛋白-α2的部分缺失则症状较轻，获得独走能力[17-19]。本组病例2肌肉病理示Merosin部分肌纤维膜表达减弱，局灶缺失，其起病相对较晚，症状也较轻，最终能独立的行走。病例3肌肉病理示Merosin表达明显减弱或缺失，出生后即出现严重症状，吮吸无力，发育里程碑落后，仅能独坐。本组3例患儿营养状态不良，体质量低下。喂养困难、吞咽异常和咀嚼困难是影响LAMA2-MD患儿体质量增加不良的原因。此外，反复感染进一步加剧了这一问题[20]。大多数早发性LAMA2-MD患儿体质量低于第三百分位，有些患儿需要肠内喂养以满足其营养需求[21-22]。

LAMA2-MD患儿精神状况正常，可有轻微智能发育迟滞或癫痫，言语认知功能通常正常，仅少数智力发育落后或合并癫痫，少数大脑皮质发育不良患儿伴难治性癫痫[23-24]。本组患儿智能发育均正常，脑电图检查均示正常儿童脑电图。层黏连蛋白-α2广泛分布于横纹肌的肌膜，同时也表达于脑血管的基膜及施万细胞基底膜，这种表达方式正是LAMA2-MD脑及周围神经系统病理基础[21]。6个月大的患者中可以观察到头颅典型脑白质病变，1岁后稳定无变化，这种表现对诊断很有帮助。本组3例患儿头颅MRI表现与既往报道一样，主要累及脑室旁和皮层下白质，而胼胝体和内囊不受累，呈长T1、长T2信号，FLAIR上呈高信号。这种改变可能缺陷影响血脑屏障的成熟和(或)功能的改变，脑血管基膜对水通透性增加，大脑含水量的变化有关[25]。此外，层黏连蛋白-α2在施万细胞基底膜均有表达，有报道其缺陷能影响周围神经髓鞘形成引起运动感觉神经病变，但临床意义不大[26]。

LAMA2-MD的致病基因LAMA2定位于6q22-23，包含65个外显子，编码分子量为390 000的laminin-α2[3]。LAMA2基因分子遗传学检测是确诊LAMA2-MD的最有效的方法，检测手段包括NGS联合MLPA、aCGH等[27]。LAMA2基因突变类型复杂多样，主要包括无义突变(32%)、微小缺失或插入(19%)、剪切突变(15%)、错义突变(12%)、拷贝数变异(20%)等[28-29]。两个LAMA2基因的功能缺失突变能导致更严重的早发型LAMA2-MD，这些突变分布在LAMA2编码区，55%聚集在14、25、26和27号外显子[17]。另一方面，错义突变、框内缺失和剪接位点突变常与晚发型LAMA2-MD相关，在这些病例仍然可以检测到层黏连蛋白-α2的残留表达。GERANMAYEH等[17]报道病例中2名患儿LAMA2基因拷贝虽然功能完全缺失，其临床表型却较温和，能够独立行走，不需要喂养或通气支持。本研究中病例1是既往已经报道过的临床病例[30]。病例2、3虽然根据肌肉活检组织病理检查所见已做出临床病理诊断，但结合免疫组织化学染色和LAMA2基因突变分析对明确诊断十分必要。2名患儿通过基因检查都检出2个LAMA2基因突变，分别来自于父亲和母亲的致病基因，符合常染色体隐性遗传遗传方式。病例2检出的一个突变是6号外显子区域c.6513_6515微缺失突变，为朱艳慧等[31]于2014年报道的致病突变，引起所编码的蛋白质第2172位的氨基酸残基Val缺失，影响laminin-α2与钙离子的结合，从而导致laminin-α2与α-抗萎缩相关糖蛋白连接受阻。另一突变为17号内含子区域发生杂合突变c.2451-6A>G，此突变为国际上尚无报道的新突变，结合免疫组化结果分析虽为未知突变，但该位点相对较为保守，推测这种突变能产生了一个新的剪接受体位点，导致编码提早终止，引起蛋白表达缺失。病例3检出的一个突变是46号外显子区域c.7810C>T杂合突变，为无义突变，引起编码产物氨基酸序列提前终止。2014年EGL基因诊断、Eurofins临床诊断已将该突变列为致病突变[27，32]。另一突变为24号内含子区域发生杂合突变c.3556-13T>A，既往43名层黏连蛋白α2缺陷型先天性肌营养不良报道中有2名患而同样有这种变异，认为该突变为致病突变，产生一个新的剪接受体位点，引起编码产物氨基酸序列提前终止[29]。

LAMA2-MD致残率和致死率高，预后差，目前缺乏有效根治性治疗方法，主要强调对患儿的多学科综合管理和长期随访[33-34]。基因检测可确定致病基因和遗传方式，对确诊的先证者家庭提供精准遗传咨询并进行产前诊断，对优生优育有重要指导意义。