汉黄芩素对糖尿病肾病模型大鼠干预作用及肾组织RAGE、S100A8 表达的影响

张 璐 傅丹青

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症[1]。糖尿病肾病与心血管疾病有关，并增加糖尿病患者的死亡率[2]。糖尿病肾病的病理生理学涉及炎症、细胞黏附分子的表达、趋化因子和促炎性细胞因子分泌[3]。晚期糖基化终末产物受体（RAGE）是高级糖化终产物（AGEs）的受体，AGE-RAGE 相互作用启动多个细胞内信号通路，这些通路激活核因子-κB（NFκB），并增加氧化应激[4]。此外，RAGE 基因的启动子区域包含两个功能性NF-κB 结合位点，它们参与RAGE 表达的调控[5]。S100 蛋白家族由21 种小的（9-13kDa）Ca2+结合蛋白组成，参与多种细胞功能，髓样相关蛋白8（S100A8）是S100 蛋白家族的成员，研究发现，S100A8 除了在炎症过程中发挥作用外，还可能在糖尿病肾病中发挥病理生理作用[6]。汉黄芩素具有抗微生物、抗病毒和抗炎特性，长期以来被用于治疗各种疾病，例如系统红斑狼疮、肿瘤、类风湿关节炎、伤口炎症等[7]。研究表明，汉黄芩素的抗炎特性归因于存在烯酮类化合物和苯丙烷类化合物，其抗氧化特性已有报道[8-9]。本研究拟探讨汉黄芩素对糖尿病肾病模型大鼠的治疗作用及肾组织RAGE、S100A8 表达的影响，为糖尿病肾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药物、试剂及仪器 汉黄芩素（原料药，纯度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号H-029，将汉黄芩素和蒸馏水配制成浓度分别为5、10mg/mL 的溶液）；厄贝沙坦片[赛诺菲（杭州）制药有限公司，批号20190916，规格：0.15g×7 片/盒]；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma Aldrich 公司，批号S09367）；尿蛋白、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血糖检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号分别为WS-7458、BG-6985、QA-2547、ZS-5896）；RNA 提取试剂盒、SYBR Premix Ex Taq 实时荧光定量PCR 试剂盒（日本Takara 公司，批号分别为RRA-2587、DRR420A）；RevertAid First Strand cDNA 逆转录试剂盒（美国Thermo 公司，批号K1622）；RIPA 裂解缓冲液（西安赫特生物科技有限公司，批号WB009）；二辛可宁酸试剂盒（厦门研科生物技术有限公司，批号YKH-28993）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜、化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究 所，批 号 分 别 为SF9101-5、FFP36、P0018M）；RAGE 一抗、S100A8 一抗、GAPDH 一抗、山羊抗鼠IgG 二抗（艾美捷科技有限公司，批号分别为ABP52321、BK003、NC0001、AMJ -AB2008）；GM300型血糖仪（瑞士Bionime 公司）；AU5800 型全自动生化仪（美国贝克曼库尔特公司）；CX23 型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；Rotor-Gene 6000 型荧光实时定量PCR 仪（德国Qiagen 公司）。

1.2 实验动物及分组 清洁级Sprague Dawley（SD）大鼠60 只，10～12 周龄，体质量180～220g，雌雄各半，购自华中科技大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2019-0001，动物使用许可证号：SYXK （鄂）2019-0045，动物质量合格证号：N0019091326。根据随机数字表法将大鼠随机分成五组：对照组、模型组、厄贝沙坦组（15mg/kg）[10]、汉黄芩素低剂量组（50mg/kg）[11]、汉黄芩素高剂量组（100mg/kg），每组12 只。大鼠单笼喂养，自由进食和饮水，环境：湿度60%、温度25°C、12h/12h 的光照/黑暗周期。本研究经台州市立医院伦理委员会审核，批准编号：伦审-2019-0117。

1.3 动物建模及给药 模型组、厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠喂食高糖高脂饲料，8 周后，禁食、禁水12h，大鼠腹膜内注射STZ 55mg/kg；对照组大鼠注射等体积生理盐水，注射72h 后，测量空腹血糖（FBG）浓度，当FBG 浓度＞16.7mmol/L，且尿蛋白＞30mg/24h 视为糖尿病肾病模型造模成功[12]。建模成功后第1 天开始，汉黄芩素低、高剂量组分别灌胃50、100mg/kg 的汉黄芩素（浓度分别为5、10mg/mL的溶液，灌胃体积10mL/kg）；厄贝沙坦组灌胃15mg/kg的厄贝沙坦（灌胃体积10mL/kg）；对照组和模型组给予等体积生理盐水（10mL/kg）；每天1 次，持续8 周。

1.4 24h 尿蛋白、Scr、BUN、血糖的测定 最后一次给药后24h，将所有动物用氯胺酮（75mg/kg）麻醉。通过心脏穿刺收集血样，快速分离血清，等分并保存在-80°C 下。取出大鼠肾脏组织样品，立即冷冻在液氮中，并保存在-70°C 进行RNA 提取。此外，将一部分肾脏组织固定在10%福尔马林中以进行组织病理学检查。使用代谢笼收集尿液，全自动生化仪测定24h 尿蛋白、Scr、BUN、血糖水平。

1.5 大鼠肾脏病理观察 将大鼠肾脏组织经乙醇脱水，石蜡包埋后，制成石蜡切片，进行HE 染色，显微镜观察大鼠肾脏病理改变。

1.6 大鼠肾脏组织RAGE、S100A8 mRNA 水平检测使用RNA 提取试剂盒从肾脏组织中分离总RNA，提取后，通过在260nm 波长处定量RNA 纯度，并通过电泳检查其质量。用RevertAid First Strand cDNA逆转录试剂盒将提取的RNA 用于合成互补DNA（cDNA）。使用SYBR Premix Ex Taq 实时荧光定量PCR 试剂盒和荧光实时定量PCR 仪通过PCR 反应确定mRNA 表达的相对量。在包含10μL SYBR Premix Ex Taq、1μL 正向引物、1μL 反向引物、1μL cDNA 模板和7μL 无核酸酶蒸馏水的20μL 总反应体系中进行。引物由碧云天生物技术研究所合成，引物序列如下：RAGE：5'-GAGTCCGAGTCTACCAGATTCC-3'（正向）和5'-GGTCTCCTCCTTCACAACTGTC-3'（反向）；S100A8：5'-TGCCCTCTACAAGAATGACT-3'（正向）和5'-AAGCTCTGCTACTCCTTGTG-3'（反向）；β-肌动蛋白：5'-GAGAAGATTTGGCACCACAC-3'（正向）和5'-CATCACAATGCCAGTGGTAC-3'（反向）。PCR 反应在以下条件下进行：在95°C 下20s（变性），55°C 30s（退火）和60°C 30s（延伸）的40个循环。根据2-ΔΔCt 方法确定RAGE 和S100A8 mRNA 的相对表达。β-肌动蛋白的表达水平用作参考基因。

1.7 大鼠肾脏组织RAGE、S100A8 蛋白水平检测将肾脏组织在RIPA 裂解缓冲液中裂解，通过二辛可宁酸试剂盒测定蛋白质浓度，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相等质量的蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用含5%脱脂牛奶的Tris 缓冲盐水封闭2h，然后与RAGE、S100A8，GAPDH 一抗（稀释比均为1:1000）在37°C 过夜，与山羊抗鼠IgG 二抗（稀释比1:5000）在室温下孵育1h，并用化学发光试剂盒进行检测。使用放射自显影胶片进行曝光和处理，Quantity One 分析软件来定量印迹蛋白的条带强度。GAPDH 用作内部对照。

1.8 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖比较模型组大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平高于对照组（P＜0.05）；厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，汉黄芩素低、高剂量组大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平降低（P＜0.05）；汉黄芩素低、高剂量组大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平高于厄贝沙坦组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖比较（）

注：对照组予10mL/kg 生理盐水灌胃；模型组予10mL/kg 生理盐水灌胃；厄贝沙坦组予15mg/kg 厄贝沙坦灌胃；汉黄芩素低剂量组予50mg/kg汉黄芩素灌胃；汉黄芩素高剂量组予100mg/kg 汉黄芩素灌胃；BUN 为尿素氮；Scr 为血肌酐；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与厄贝沙坦组比较，cP＜0.05；与汉黄芩素低剂量组比较，dP＜0.05

2.2 各组大鼠肾组织HE 染色比较 对照组肾小球结构正常；模型组肾小管上皮细胞胞质不完整、脱落，出现明显炎性浸润，基底膜增厚；厄贝沙坦组及汉黄芩素低、高剂量组炎性浸润、肾小管扩张程度、肾小球增大明显改善。见插页图1。

2.3 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平比较 模型组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平高于对照组（P＜0.05）；厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA水平降低（P＜0.05）；汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平高于厄贝沙坦组（P＜0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平比较模型组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平高于对照组（P＜0.05）；厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平降低（P＜0.05）；汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平高于厄贝沙坦组（P＜0.05）。各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白电泳深浅程度与表3 结果符合。见表3，插页图2。

3 讨论

糖尿病是胰岛素分泌不足或胰岛素敏感性降低引起的代谢综合征[13]。糖尿病控制不良会引起严重的微血管并发症，包括视网膜病变、神经病变、肾病和大血管并发症[14]。汉黄芩素是从黄芩中提取的一种化合物，是类黄酮家族的成员，具有抗氧化特性[15]。本研究显示，汉黄芩素低、高剂量组大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平降低（P＜0.05）；结合病理学结果：厄贝沙坦组及汉黄芩素低、高剂量组肾组织炎性浸润、肾小管扩张程度、肾小球增大明显改善，表明汉黄芩素对大鼠糖尿病肾病具有明显治疗效果。

表2 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平比较（）

表2 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 mRNA 水平比较（）

注：对照组予10mL/kg 生理盐水灌胃；模型组予10mL/kg 生理盐水灌胃；厄贝沙坦组予15mg/kg 厄贝沙坦灌胃；汉黄芩素低剂量组予50mg/kg 汉黄芩素灌胃；汉黄芩素高剂量组予100mg/kg 汉黄芩素灌胃；RAGE 为晚期糖基化终末产物受体；S100A8 为髓样相关蛋白8；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与厄贝沙坦组比较，cP＜0.05；与汉黄芩素低剂量组比较，dP＜0.05

表3 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平比较（）

表3 各组大鼠肾组织RAGE、S100A8 蛋白水平比较（）

注：对照组予10mL/kg 生理盐水灌胃；模型组予10mL/kg 生理盐水灌胃；厄贝沙坦组予15mg/kg 厄贝沙坦灌胃；汉黄芩素低剂量组予50mg/kg 汉黄芩素灌胃；汉黄芩素高剂量组予100mg/kg 汉黄芩素灌胃；RAGE 为晚期糖基化终末产物受体；S100A8 为髓样相关蛋白8；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与厄贝沙坦组比较，cP＜0.05；与汉黄芩素低剂量组比较，dP＜0.05

AGEs 与糖尿病肾病的发展有关[16]，AGE-RAGE相互作用可通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶提高活性氧（ROS）的产生。ROS 的过度生成导致氧化应激，氧化应激被认为是肾脏疾病的共振器，可诱导NF-κB 表达[17]。此外，AGERAGE 相互作用导致诸如NF-κB 等压力敏感信号级联的激活，研究显示[18]，在糖尿病小鼠中观察到RAGE 的过表达，并加剧了肾脏疾病的发展。本研究结果表明，模型组大鼠肾组织RAGE mRNA 和蛋白水平高于对照组（P＜0.05）；厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠肾组织RAGE mRNA 和蛋白水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，大鼠肾组织RAGE mRNA 和蛋白水平降低（P＜0.05）。说明RAGE 在糖尿病肾病模型大鼠中过表达，而汉黄芩素抑制糖尿病肾病模型大鼠肾组织RAGE mRNA 和蛋白表达有剂量依赖性。此外，研究发现，RAGE 的基因缺失可以有效减少DN 早期的原发性肾功能损害和肾小球结构改变，这与本研究结果符合[19]。AGEs 可诱导S100A8 mRNA 表达增加，S100A8 是RAGE 的一种配体，它通过激活NF-κB信号传导参与促炎细胞因子的分泌，研究证明S100A8 在糖尿病小鼠中的表达升高[20]。研究显示，在糖尿病大鼠中，纹状体链球菌以剂量依赖性方式下调S100A8 表达，纹状体链球菌对S100A8 基因转录的抑制有助于肾脏功能的改善[21]。本研究结果显示，厄贝沙坦组、汉黄芩素低、高剂量组大鼠S100A8 mRNA 和蛋白水平低于模型组（P＜0.05），且随着汉黄芩素剂量的增加，大鼠S100A8 mRNA 和蛋白水平降低（P＜0.05）；说明汉黄芩素可对糖尿病肾病大鼠S100A8 mRNA 和蛋白产生抑制作用，其效果与纹状体链球菌相似。

综上所述，汉黄芩素对糖尿病肾病大鼠模型具有明显治疗效果；其机制可能与汉黄芩素可对糖尿病肾病大鼠肾脏组织RAGE、S100A8 mRNA 和蛋白产生抑制作用有关。