非酒精性脂肪性肝病进展中肝组织细胞衰老相关基因P21、SIRT6 和NF-κB mRNA 表达

谢益文 徐素美 陈芝芸 杨晴柔 何蓓晖

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率与日俱增，已成为最常见的慢性肝病之一。其疾病谱范围从单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎，并逐渐向肝硬化、肝癌等终末期肝病进展[1]。研究发现，NAFLD 中聚集着肝细胞衰老现象[2-3]。课题组前期采用高脂诱导小鼠NAFLD 模型发现，随高脂喂养时间的增加，模型动物血脂紊乱加重，血清肝酶逐步增高；肝组织病理显示，在8 周时肝脏以肝细胞脂肪变为主，有轻度炎症的表现；16 周时肝组织脂肪变加重，炎症明显，并有肝细胞气球样变的表现；至24 周时肝组织在脂肪变和炎症基础上出现纤维化的表现[4]。为进一步研究肝细胞衰老在NAFLD 进程中的作用，本研究动态观察高脂诱导的NAFLD 模型小鼠8、16、24 周3 个时间点肝组织肝细胞衰老相关基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（P21）、沉默信息细节因子6（SIRT6）、核转录因子κB（NF-κB）表达的变化，探讨SIRT6/NF-κB 通路在阻遏NAFLD 模型小鼠肝细胞衰老的作用。

1 实验材料

1.1 动 物 48 只健康雄性8 周龄C57BL/6 小鼠，SPF 级，体质量（190±10）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号[SCXK（沪）2017-0005]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统中，温度（20±2）℃，相对湿度40%～60%，适应性饲养1 周后开始实验。本实验研究经浙江中医药大学实验动物中心实验伦理审核通过（批准编号：10717）。

1.2 试 剂 高脂饲料（批号20170227）为南通特洛菲饲料科技有限公司提供；总RNA 提取试剂盒（批号AK1703）、反转录试剂盒（批号AK5301）、荧光定量PCR 试剂盒（批号AH80345A）为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 引 物 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 引物由上海生工生物工程技术服务在限公司设计并合成。用β-actin 作为内参。引物序列如下：SIRT6 上游引物：5'-CTCCAGCGTGGTTTTCCACA-3'，下游引物5'-GCCCATGCGTTCTAGCTGA-3'，扩增片段：184bp；P21上游引物：5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，下游引物5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'，扩增片段：103bp；NF-κB 上游引物：5'-ATGGCAGACGAT-GATCCCTAC-3'，下游引物：5'-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3'，扩增片段：117bp；β-actin 上游引物5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'，扩增片段：138bp。

2 实验方法

2.1 分组及造模 48 只小鼠，适应性饲养1 周，用随机数字表法分为正常组、模型组，每组24 只，每日称重，正常组小鼠每天予普通饲料喂养，模型组小鼠每天予高脂饲料（10%熟猪油、5%蛋黄粉、2%胆固醇、0.5%3 号胆盐、普通饲料82.5%）喂养。正常组和模型组分别于喂养第8、16、24 周末各处理8 只小鼠。具体处理方法：小鼠处理前晚禁食不禁水，次日上午空腹麻醉下取肝组织，-80℃保存待用。

2.2 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表达水平的测定按照总RNA 提取试剂盒使用说明书提取上述肝组织总RNA，并计算RNA 纯度和浓度。根据反转录试剂盒说明书将提取的总RNA 反转录为cDNA，最后以cDNA 为模板按荧光定量PCR 试剂盒说明书进行Realtime-PCR 扩增反应，以β-actin 为内参，以相对表达量（2-△△CT）方法计算肝组织中P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表达水平。

2.3 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件包进行分析统计，数据以均数±标准差（） 表示，计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用非参数秩和检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

采用高脂饮食诱导NAFLD 模型小鼠，分别在第8、16、24 周观察肝组织SIRT6、NF-κB、P21 mRNA表达，结果发现在造模第8 周时模型组SIRT6 mRNA 表达较正常组同期明显增高（P＜0.05），16 周时较正常组同期有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），而24 周时则较正常组同期明显下降（P＜0.05）；模型组小鼠肝组织NF-κB mRNA 表达随造模时间增加而稍有增强，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；造模第8 周，模型组P21 mRNA 表达与正常组同期差异无统计学意义（P＞0.05），在造模第16 周和24 周则较正常组同期显著增强（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 高脂诱导的NAFLD 小鼠肝组织衰老相关基因mRNA 表达（）

表1 高脂诱导的NAFLD 小鼠肝组织衰老相关基因mRNA 表达（）

注：正常组给予普通饲料喂养；模型组给予高脂饲料喂养；P21 为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A；SIRT6 为沉默信息细节因子6；NF-κB 为核转录因子κB；β-actin 为β-肌动蛋白；与正常组同期比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

4 讨论

NAFLD 聚集着肝细胞衰老现象，其肝细胞有端粒过早缩短、细胞核增大、P21 表达增加、细胞周期停滞等细胞衰老表现；正常肝脏中，肝细胞端粒长度不会发生改变，在慢性肝炎和肝硬化中，肝细胞出现端粒缩短和衰老表现，而组织区域内其他细胞，如肝淋巴细胞和肝星状细胞（HSC）未发现此现象[5]。本实验结果显示，采用高脂饮食诱导建立NAFLD 模型小鼠，分别在8、16、24 周观察肝组织P21 mRNA 表达，结果发现P21 mRNA 在高脂16 周和24 周则较同期正常组显著增强，提示肝细胞衰老发生聚集。

SIRT6 是近年来研究衰老的热点[6]。NF-κB 是SIRT6 的下游调控分子，研究发现SIRT6 可与NFκB RELA 亚单位结合，促进NF-κB 靶基因启动子H3K9 脱乙酰作用而发挥调控细胞增殖分化和抗细胞衰老的功能[7]。研究已证实SIRT6 可抑制NF-κB表达起到对人皮肤成纤维细胞、造血干细胞、心肌细胞的抗衰老作用[8-9]。

本实验研究表明，在NAFLD 进展过程中，SIRT6 mRNA 在疾病早期（造模8 周）较正常组同期上调，而后期（造模24 周）则较正常组同期显著下调，其疾病早期的上调，考虑NAFLD 小鼠为了抵抗氧化应激，代偿性增高。随着疾病的进展，SIRT6 基因的表达逐渐受到抑制，在后期显著下降。NF-κB mRNA 在本实验中随着造模时间增加而稍有增强，但均差异无统计学意义（P＞0.05），我们推测NF-κB 基因，受多因素调控，在NAFLD 肝细胞的衰老中并不是主要激活路径。

随着NAFLD 进展，出现肝细胞衰老聚集现象，SIRT6 在疾病进展中出现特征性的先升高后降低趋势，与NAFLD 疾病的发展机制相一致，由此我们推测，肝细胞衰老参与NAFLD 进程，SIRT6 基因在肝细胞衰老过程中起着重要作用。因此，通过干预SIRT6 基因，阻遏肝细胞衰老，可能成为NAFLD 治疗的潜在靶点。