加味黄风汤对糖尿病肾病模型大鼠肾组织8-OHdG 表达的影响

张培培 夏 虹 鲁科达 何灵芝 马红珍

糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症，若病情控制不佳进入尿毒症期，需进行维持性血透，患者生活质量明显下降，医疗费用明显增加。8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）作为氧化应激的代谢产物，既往观察到糖尿病、肿瘤等患者血清中含量均有所升高[1-3]。而腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）作为机体供能的主要来源，在氧化应激状态下往往处于过渡消耗，进一步加重机体缺氧，细胞凋亡，器官病变。临床实践证实加味黄风汤对控制糖尿病患者蛋白尿、延缓肾功能进展有较好效果[4-5]。本研究拟通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备大鼠糖尿病肾病模型，观察加味黄风汤对大鼠微量白蛋白尿、血糖、血清肌酐水平、肾脏光镜及电镜病理改变及肾组织8-OHdG 和ATP 水平的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级健康雄性SD 大鼠，体质量（250±10）g，共40 只，医学动物许可证号码：SCXK（沪）2013-0016，由浙江中医药大学实验动物中心提供，全封闭SPF 状态下隔离标准饲料饲养。本实验已通过浙江中医药大学实验动物管理和伦理委员会批准（批准编号：ZSLL-2015-115）。

1.2 药物制备 加味黄风汤配置：黄芪30g，蝉衣6g，防风、僵蚕、独活各10g（广东一方制药有限公司，颗粒制剂）溶于70mL 蒸馏水中，震荡充分至混匀，溶解，此为低剂量，生药含量为0.94g/mL。加味黄风汤高剂量浓度为低剂量的2 倍，其生药含量为1.88g/mL。

1.3 仪器与试剂 全自动生化分析仪（HITACHI，日本）；石蜡组织切片机（Thermo，HM340E，德国）；透射电镜（HITACHI，H-7650 TEM，日本）；全自动酶标记仪器（Bio-Rad，1681130-4B，美国）。荧光定量PCR仪（Bio-Rad，IQ5，美国）。STZ（美国Sigma 公司，批号Sigma S0130）；尿微量白蛋白ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号AK0015OCT29001）；鼠8-OHdG ELISA Kit（CSB-E10526r，96T，Cusabio公司）；Highly Stable ATP Assay Kit（KA3727，100T，Abnova 公司）。BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0010，碧云天公司）。荧光酶标仪（The mμLti-mode microplate reader，FLUOstar Omega，BMG LABTECH公司）。

2 实验方法

2.1 分组与糖尿病肾病模型制备 40 只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、加味黄风汤低剂量组及加味黄风汤高剂量组，每组10 只。造模前12h 大鼠禁食不禁水，空白对照组正常大鼠10 只腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其余30只予一次性腹腔注射55mg/kg STZ，STZ 以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释。给药后观察饮水、饮食量以及24h 尿量，72h 后大鼠尾尖采血测空腹血糖，并检测尿糖试纸定性，连续3 天。空腹血糖＞16.7mmol/L，或随机血糖＞22.2mmol/L，尿糖定性强阳性，尿量＞空白对照组的150%，连续3 天达到以上标准，确定糖尿病造模成功。继续饲养4 周，以尿微量白蛋白＞15μg/mL确定糖尿病肾病造模成功。

2.2 给 药 空白对照组及模型组每天1 次蒸馏水灌胃，用量10mL/kg，加味黄风汤低、高剂量组每天1次予0.94、1.88g/mL 加味黄风汤灌胃，用量10mL/kg，每周根据体质量调整用量，共8 周。

2.3 标本留取 于实验结束前收集大鼠24h 尿液，检测24h 尿微量白蛋白。实验结束时腹主动脉取血分别留取血标本，分离血清，－20°C 保存，并取部分肾组织放入10%多聚甲醛溶液中固定，用于石蜡切片，进行HE 染色光镜检查；取部分组织于2.5%戊二醛溶液中4°C 固定过夜，用于投射电镜包埋切片样品的制备，进行电子显微镜检查；其余肾组织置液氮中冷冻后以－80℃冰箱保存备用。

2.4 ELISA 检测大鼠肾组织8-OHdG 表达水平 将各种试剂移至室温（18～25℃）平衡至少30min，按前述方法配制试剂，备用。加样：分别设标准品孔，待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL（样本200 倍稀释后进行后续检测），轻轻晃动混匀，附上板贴，37℃温育2h。为保证检测结果的准确性，标准品及样本均设置双孔测定。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μL，附上新的板贴，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干。每孔加辣根过氧化物标记亲和素工作液100μL，附上新的板贴，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15～30min。依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。在反应终止后5min 内用酶标仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。可将标准品及样本值减去S0 孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，绘出标准曲线。用标准品的浓度与OD 值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的OD 值代入方程式，计算出样本浓度。若样本检测前进行过稀释，最后计算时需乘以相应的稀释倍数，即为样本的实际浓度。

2.5 Luminescence 检测大鼠肾组织ATP 水平 （1）Reaction Mix：准备足够试剂用于要检测分析的样本和标准品。每孔检测混匀：1×Reaction Buffer 80μL及Enzyme Mix10μL，混匀后置于室温1～2h。样本准备：快速混匀10mg 样本和100μL 1×Reaction Buffer。最大转速离心30s 除去沉淀，液体样本可直接使用或用Reaction Buffer 稀释后使用。标准曲线：为检测样本中的绝对ATP 含量，须制作ATP 标准曲线。取990μL dH2O 加入10μL ATP 储备液制备成10-4M ATP 溶液，标为S1。然后制备3～5 个10 倍比稀释液（例如：10μL+90μL Reaction Buffer 制备S2、S3、S4、S5，浓度分别为10-5M，10-6M，10-7M，10-8M）检测：在96 孔板所需孔中加入90μL Reaction Mix。每个孔中分别加入10μL 标准品或样本（每孔10μL 10-4M ATP 含量为1nmol，每孔10μL 10-7M ATP 含量为1pmol）。适度混匀并读取荧光。（2）蛋白浓度检测：将2mg/mL 标准牛血清蛋白按0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8μL 加到96 孔板的孔中，在样本孔中加入上述检测步骤中样本准备的各样本1μL。将A 液和B 液按24:1 混合，各孔中加入AB 混合液200μL，充分混匀，37℃放置30min。测定570nm 处的吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。（3）计算结果：绘制标准曲线。将测得样品RLU 值代入标准曲线得到样本孔中ATP 总量Sa（pmol）。样本中ATP 浓度：C=Sa/Sv（pmol/μL 或nmol/mL，或μM）Sa 为代入标准曲线后的ATP 总量（pmol）。Sv 为加入样本孔的样本体积（μL）。ATP 浓度换算：ATP（pmol/mg）=样本ATP 浓度（pmol/μL）/样本蛋白浓度（mg/μL）。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析（one way ANOVA），有显著差异者用SNK（Student-Newman-KeμLs）-q 检验进行两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠治疗前后24h 尿微量白蛋白水平变化在实验过程中，模型组中有1 只大鼠因不能耐受高血糖（血糖值已测不出）死亡，其余各组大鼠生长良好。治疗前，模型组与空白对照组比较，24h 尿微量白蛋白增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，加味黄风汤高、低剂量组较治疗前24h 尿微量白蛋白水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与低剂量组比较，加味黄风汤高剂量组24h 尿微量白蛋白下降更明显，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠24h 尿微量白蛋白水平比较（μg，）

表1 各组大鼠24h 尿微量白蛋白水平比较（μg，）

注：空白对照组及模型组给予蒸馏水灌胃；加味黄风汤低、高剂量组给予0.94、1.88g/mL 加味黄风汤灌胃；与空白对照组同期比较，aP＜0.05；与本组治疗前比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05

3.2 各组大鼠治疗前后血糖及血肌酐水平变化 治疗前模型组与空白对照组相比血糖升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，加味黄风汤高、低剂量组较治疗前血糖水平明显下降（P＜0.05）；与低剂量组比较，加味黄风汤高剂量组血糖下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各组间血清肌酐水平无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠治疗前后血糖及肌酐水平比较（）

表2 各组大鼠治疗前后血糖及肌酐水平比较（）

注：空白对照组及模型组给予蒸馏水灌胃；加味黄风汤低、高剂量组给予0.94、1.88g/mL 加味黄风汤灌胃；与空白对照组治疗前比较，aP＜0.05；与本组治疗前比较，bP＜0.05

3.3 各组大鼠治疗前后肾组织病理改变 治疗前模型组与空白对照组比，肾组织切片光镜可见肾小球体积增加，系膜区增宽，系膜基质增多；加味黄风汤治疗后，肾小球肥大及系膜基质增生减轻。电镜下模型组可见肾小球系膜区增宽，部分足突融合，足突间隙增宽甚至消失，基底膜增厚。与模型组比较，加味黄风汤低、高剂量组足突融合、基底膜增厚情况均有所改善。见插页图1。

3.4 各组大鼠肾组织8-OHdG 和ATP 表达水平模型组大鼠肾组织8-OHdG 表达水平较空白对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。加味黄风汤低、高剂量组较模型组8-OHdG 表达水平均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。加味黄风汤高剂量组8-OHdG 表达水平低于低剂量组，但二者差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠肾组织ATP 表达水平较空白对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。加味黄风汤低、高剂量组较模型组ATP 表达水平均有所上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。加味黄风汤高剂量组ATP 表达水平高于低剂量组，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肾组织8-OHdG 及ATP 水平比较（）

注：空白对照组及模型组给予蒸馏水灌胃；加味黄风汤低、高剂量组给予0.94、1.88g/mL 加味黄风汤灌胃；8-OHdG 为8-羟基脱氧鸟苷；ATP 为腺嘌呤核苷三磷酸；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

4 讨论

加味黄风汤由黄芪、防风、蝉衣、僵蚕、独活等组成，益气祛风，标本兼治，用于临床30 余年，疗效显著。我们既往的临床研究表明，加味黄风汤可显著改善糖尿病肾病患者临床症状，降低蛋白尿水平，保护肾脏功能，在动物实验中也观察到加味黄风汤可通过上调糖尿病大鼠肾组织SIRT1 及PGC-1α 表达水平，降低蛋白尿，该信号通路与细胞能量代谢密切相关，可起到较好的足细胞保护作用[5-7]。

糖尿病肾病的发生及进展与患者体内的氧化应激密切相关。8-OHdG 是DNA 氧化损伤途径中形成，在体内稳定存在，其含量可反映机体氧化损伤程度。既往研究表明，8-OHdG 在糖尿病、冠心病、肝癌等多种疾病中表达水平升高，经过治疗8-OHdG 水平可下降[8-9]。本研究中亦观察到在糖尿病肾病大鼠肾组织8-OHdG 水平较正常大鼠明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。而经过中药复方加味黄风汤的治疗，8-OHdG 表达水平明显下降，蛋白尿亦下降（P＜0.05）。在1 型糖尿病患者中观察到，血浆中较高的8-OHdG 浓度水平与患者的肾脏并发症风险增加呈独立相关，该标志物可用于评估糖尿病肾病的发生与进展[10]。8-OHdG 不仅是2 型糖尿病患者微血管病变有效的生物标志物，也是大血管并发症的重要生物标志物[11-12]。8-OHdG 亦参与肾间质纤维化的发生及进展。在单侧输尿管梗阻模型中，血8-OHdG作为氧化应激过程中DNA 氧化损伤的主要代谢产物与大鼠肾间质纤维化的进展存在相关性[13]。在慢性肾脏病患者中，还观察到8-OHdG 在尿液及血液中表达增高[14-16]。糖尿病肾病患者随着蛋白尿的增多及肾功能的进展其氧化应激水平增强，氧化应激的重要标志物8-OHdG 作为重要因素参与糖尿病肾病的发生与发展[17]。综上所述，降低糖尿病肾病患者的8-OHdG 水平可能缓解糖尿病肾病的进展，我们的研究在动物实验中证实加味黄风汤可降低糖尿病肾病肾组织中8-OHdG 的表达水平，保护肾功能。

肾组织能量需求最高的细胞为足细胞及肾小管上皮细胞。ATP 与细胞能量代谢密切相关，足细胞结构的维持及功能需要大量的ATP。既往研究表明，在氧化应激条件下，细胞对ATP 的供能需求激增，大量ATP 消耗；缺乏足够的ATP 供能，细胞的氧化应激加剧，ROS 损伤加重，在肾脏可观察到足细胞损伤，蛋白尿形成，进一步激发肾脏局部及全身的炎症反应，造成肾功能不断恶化[18-20]。本实验观察到在糖尿病肾病模型大鼠肾组织ATP 水平明显减少。通过中药复方加味黄风汤的治疗，治疗组肾组织ATP 水平改善。

本实验结果表明，糖尿病肾病模型大鼠肾组织8-OHdG 表达明显上升，ATP 表达水平下降，出现蛋白尿，足细胞损伤。加味黄风汤可下调糖尿病肾病模型大鼠肾组织的8-OHdG 表达水平，提高肾组织的ATP 水平，减轻蛋白尿水平，并可改善血糖，保护肾功能。