茄根醇提物治疗Ⅱ度冻伤模型大鼠实验研究

顾心奇 周卢姗 彭心怡 郑慧华 王 萍

轻度冻伤是一种局限性炎性损害，常于寒冷冬季发病。多出现手、足、鼻尖、耳廓和面颊等处的组织损伤，初起受冻部位皮肤苍白、麻木冷感，继而水肿或青紫形成淤斑，自觉灼痛、瘙痒等。茄根作为中药茄的一部分，被广泛应用于多种消炎镇痛领域。早在《开宝本草》中对茄根就有记载“茄根主冻疮，可煮作汤渍之良”[1]。茄，具有清热止血、祛风利湿、散瘀消肿、止痛等功效，其根可用于治疗风湿热痹、久痢不止、女阴挺出以及冻疮等症[2]。实验证明，茄根煎液在治疗大鼠Ⅱ度冻伤时不同给药途径均可改善微循环障碍，其中外涂效果更优于灌胃[3]。药理研究证明，茄根热浸法浸出物含量较高，并指出虽然水浸出物高于醇浸出物，但因茄根中的有效成分多为醇溶性，故仍应选择70%乙醇作为提取溶剂[4]。本实验设计并观察茄根醇提物对Ⅱ度冻伤大鼠皮肤损伤修复、病理形态、血液流变学的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF 级SD 大鼠15 只，雄性8 只、雌性7 只，体质量140～160g，购自上海BK 公司，动物合格证号SCXK（沪）2018-0006，伦理编号10750，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，温度（22±2）℃，湿度40%～70%，噪音60 分贝以下，光照12h 明12h 暗，进食饮水自由。

1.2 药品与试剂 茄根（批号190211），购自亳州市大西北药业有限责任公司。70%乙醇（批号180802），购自太仓新太酒精有限公司。液氮（浙江中医药大学基础医学院实验中心提供）。对乙酰氨基酚（批号L24O10G101047），10%水合氯醛（批号B14A9E58 584），生理盐水（批号L16J11G108436），购自上海源叶生物科技有限公司。尿素维E 乳膏（批号181011），购自宿州亿帆药业有限公司。

1.3 仪 器 众驰ZL9100 全自动血流变测试仪，购自北京众驰伟业科技发展有限公司。

2 实验方法

2.1 茄根醇提物制备 2kg 茄根打粉，加入70%乙醇6L，密塞静置1h。连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸状态1h。过滤静置，上层清液经旋转蒸发仪浓缩为1g/mL 的茄根醇提物，避光冷藏。

2.2 大鼠冻伤模型建立与给药 SPF 级别SD 大鼠15 只，随机数字表法分为生理盐水组、茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组，每组5 只。适应性饲养1 周。提前禁食12h 后进行造模，以苗明三《冻伤动物模型制备规范（草案）》[5]为蓝本，使用液氮法于大鼠背部行Ⅱ度冻伤造模。实验过程中大鼠经10%水合氯醛麻醉、对乙酰氨基酚镇痛，符合伦理学标准。麻醉镇痛后的大鼠经剃刀、硫化钠溶液共同作用，在背部脱毛裸露约30mm 左右的圆形区域。使用直径20mm 的铁棒浸入液氮充分冷却15min 后，贴紧大鼠皮肤表面10s 进行造模。局部有充血和水肿、有水疱形成，水疱液为浆液性或淡血性、水疱基底呈鲜红色且潮湿，皮温较高，吻合度≥90%即为造模成功。造模成功24h 后给药。根据《中药外用药理实验技术规范（草案）》[6]，各组在给药前以温生理盐水清洗给药部位，后采取外用棉签点涂法，给药量约1mL/100g，即以给药区均匀涂覆薄薄一层为标准。给药频率每天2次，时间间隔9h。生理盐水组予2mL·100g-1·d-1生理盐水；茄根醇提物组予2mL·100g-1·d-1茄根醇提取物，尿素维E 乳膏组予2mL·100g-1·d-1尿素维E 乳膏。

2.3 观察指标 造模成功后第18 天进行病理指标、血液指标的采样。提前禁食12h 后进行采样，大鼠经10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，取血完毕后静注过量10%水合氯醛处死，完成局部皮肤病理组织的采样。

2.3.1 表观指标 参照《冻伤动物模型制备规范（草案）》[5]，拟定表观指标评分。给药同时，每天观察1 次患处皮肤表观情况并做好记录，根据局部皮肤表观情况采取等级半定量积分法进行统计。计分方式为：皮肤颜色粉红/红/暗红计1/2/3 分；皮肤温度稍增高/增高/明显增高计1/2/3 分；皮肤感觉刺痛/灼痛/痛觉敏感计1/2/3 分；水疱视大小、疱壁、疱皮颜色、疱液颜色等指标分别计1/2/3 分；痂皮稍薄、棕色/薄、褐色/稍厚、黑色计1/2/3 分；渗出液少/稍多/多计1/2/3分。计算造模后表观指标的差值，即“造模第3、6、9、12、15、16 天表观指标评分-造模第1 天表观指标评分”，差值为正提示冻伤局部状况加重，差值为负提示冻伤局部情况减轻。

2.3.2 病理形态 在冻伤部位中心区域内切取约1cm×1cm×1cm 的皮肤组织，放入中性甲醛固定瓶内，经脱水、石蜡包埋、切片、HE 染色、封片固定后，以《冻伤动物模型制备规范（草案）》为基础在光学显微镜下观察局部组织的病理形态。

2.3.3 血液流变学 腹主动脉取血1mL，肝素钠抗凝，经众驰ZL9100 全自动血流变测试仪检测血浆黏度、全血黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原、红细胞内黏度等指标。

2.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（） 表示。首先对各组数据行正态性检验，满足正态分布则对相关组间数据行方差齐性检验，在符合方差齐性的条件下，行单因素ANOVA 检验，LSD 法行组间差异比较；若单组数据不符合组内正态分布，或相关组间数据不符合方差齐性，则对相关数据行Mann-Whitney 检验。P＜0.05则认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 表观指标 造模第1 天，生理盐水组、茄根醇提物组和尿素维E 乳膏组大鼠冻伤局部表观指标评分分别为（10.60±1.82）分、（12.00±1.58）分、（11.60±1.67）分，各组评分差异无统计学意义（P＞0.05），示造模成功组间基线可比。造模后表观指标整体变化趋势先加重后减轻。造模后第3 天差值普遍增大、冻伤加重，第6 天差值普遍减小、冻伤恢复，其中茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组较生理盐水组有显著差异（P＜0.05）。造模后第9、12、15、16 天差值普遍呈下降趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2 病理指标 生理盐水组表皮较厚，可见明显角化层、大量炎细胞、肉芽组织。茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组炎细胞少、皮下血管较多、有肉芽组织和毛囊出现。见插页图1。

3.3 血液流变学指标 茄根醇提物组血液流变学指标较生理盐水组稍有降低但差异无统计学意义（P＞0.05）。茄根醇提物组血浆黏度、全血黏度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原显著低于尿素维E 乳膏组（P＜0.05）。尿素维E 乳膏组血浆黏度、纤维蛋白原高于生理盐水组（P＜0.05）。见表2。

4 讨论

茄根内含丰富生物碱类、酸性成分、苯丙酰胺类成分，常用于祛风利湿，清热止血，抗炎等[7]。现代药理学研究证明，苯丙酰胺衍生物和甾体生物碱等生物碱成分是其活血、镇痛的主要有效成分，多为茄科植物特有[2]。故应用茄根治疗冻伤具有多重优势。

表观指标显示，造模第3 天各组评分差值增大，第6 天茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组较生理盐水组有显著差异（P＜0.05），第9、12、15、16 天茄根醇提物组和尿素维E 乳膏组较生理盐水组偏小但无统计学意义。符合冻伤病理的阶段性进展，即第3 天处于融化后反应期，为冻融后血管扩张、充血、渗出的过程，第9 天后各组均呈愈合趋势[8-9]。提示一定时间内，茄根醇提物能显著促进局部冻伤恢复，与尿素维E 乳膏效果相仿。

表1 各组大鼠冻伤局部表观指标评分差值比较（分，）

表1 各组大鼠冻伤局部表观指标评分差值比较（分，）

注：生理盐水组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 生理盐水；茄根醇提物组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 茄根醇提物；尿素维E乳膏组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 尿素维E 乳膏；统计指标为“造模第3、6、9、12、15、16 天表观指标评分-造模第1 天表观指标评分”，差值为正提示冻伤局部状况加重，差值为负提示冻伤局部情况减轻；与生理盐水组同期比较，aP＜0.05

表2 造模第18 天各组大鼠血液流变学指标比较（）

表2 造模第18 天各组大鼠血液流变学指标比较（）

注：生理盐水组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 生理盐水；茄根醇提物组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 茄根醇提物；尿素维E乳膏组为Ⅱ度冻伤模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 尿素维E 乳膏；与生理盐水组比较，aP＜0.05；与尿素维E 乳膏组比较，bP＜0.05

病理形态示茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组较生理盐水组炎细胞显著减少。茄根的药理活性研究示其水提液、水煎剂和酸性组分均具抗炎作用，可能与苯丙酰胺类活性成分有关，对冻伤局部有良好抗炎作用，可促进肉芽组织生成和表皮愈合恢复[2，7]。提示抗炎作用为茄根治疗局部冻伤的重要机制之一。

血液流变学指标示冻伤第18 天茄根醇提物组、尿素维E 乳膏组较生理盐水组无显著差异，与白强等[3]实验示冻伤第12 天茄根水煎液外涂组各项指标均显著优于模型组（P＜0.01）的结果不同。综合本实验结果，推测可能原因为：（1）本实验造模Ⅱ度冻伤，反应程度较轻，局部组织无持续的内皮脱落、出血等，血液黏滞状态较轻；（2）茄根醇提物、尿素维E 乳膏均有显著疗效，在用药早期即缓解了血液高黏滞状态，因检测较晚，轻度冻伤自我修复，差异无法体现；（3）传统观点认为治疗重度冻伤，及时阻断血液高黏滞状态的恶性循环是治疗的关键[10]。但本实验发现轻度冻伤后期，是否用药对血液流变学指标无明显影响。杨成等[11]实验示冻伤组织学改变3 天时集中在血管壁破裂与内出血、2 周时集中在炎性反应，结合苗明三等[5]综合权重评分标准，推测轻度冻伤状态下，前期主要为血液流变学方面的改变，后期转入炎性反应和自我修复阶段。提示针对轻度冻伤，后期治疗应着眼于抗炎。尿素维E 乳膏组血浆黏度、纤维蛋白原显著高于生理盐水组（P＜0.05），可能与维E 存在引起血栓形成、动脉粥样硬化的趋势有关[12]。茄根醇提物组血浆黏度、全血黏度切变率、红细胞聚集指数、纤维蛋白原显著低于尿素维E 乳膏组（P＜0.05），提示茄根醇提物可能存在心血管方面的作用。

综上所述，在相关实验开展时，血液流变学指标的检测应在早期进行，同时建议开展冻伤大鼠血液流变学指标阶段性测试，研究其发生发展的规律，为后续实验设计提供参考。

现代研究证实，茄根总生物碱可延长小鼠凝血时间，茄根醇提物可促进小鼠耳廓微循环，适用于冻伤早期血液流变学的恢复[13-14]。且其水提液、水煎剂、酸性组分均具有抗炎作用，其酸性组分对以毛细血管通透性改变、局部肿胀为特征的急性炎症模型尤为有效，适用于冻伤中后期炎症的恢复[7]。可见茄根治疗冻伤，兼具活血、抗炎效果。