养殖实训场常见病原菌调查

张业怀

（广西农业职业技术学院，南宁530007）

细菌在自然界分布极为广泛，存在于土壤、水、空气、动物的体表及其与外界自然环境相通的腔道内，这些细菌大部分对动物生长是有益的，但也有一部分是病原菌或条件性致病菌，对动物有致病性。细菌的存活时间受到外界环境中包括温度、湿度、光照、营养物质、酸碱度及细菌之间的相互作用等各种因素的影响，不同的细菌因其结构与生物学特性不相同而对外界环境的适应能力也不一样，导致不同的环境中存在的细菌种类也不同。

近年来，高职院校养殖实训场引进、饲养动物的种类及数量随着畜牧兽医专业招生规模的扩大而不断增加，由此造成周围环境细菌数量和种类也发生相应的变化，病原菌及一些条件性致病菌在一定条件下导致动物发病的现象时有发生，不仅影响动物的生长，而且也威胁着师生的安全。为此，本课题组开展养殖实训场环境常见病原菌种类和数量的调查，以全面掌握养殖实训场周围环境的细菌污染现状及致病菌的种类，为养殖实训场卫生消毒及饲养管理制度的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

采集广西农业职业技术学院养殖实训场动物栏舍中的空气、栏舍排污水及近处的池水、栏舍周边土壤的样品。

1.2 培养基及试剂

普通琼脂培养基、葡萄糖血清琼脂培养基、蛋白胨肉汤培养基、兔新鲜血浆及3% H2O2溶液均由本实验室提供。厌氧肉肝汤培养基、硝酸盐培养基、牛奶培养基、SS琼脂、血平板、TCBS琼脂、三糖铁琼脂培养基、M.S.P培养基、蛋白胨酵母膏平板、刚果红培养基、BS琼脂、HE琼脂、肝汤琼脂、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂培养基、沙门氏菌显色培养基、甘露醇卵黄多粘素（MYP）平板及生化鉴定所用各种细菌微量发酵管、氧化酶试验试剂及硝酸盐还原试验试剂等均购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 实验动物

小白鼠（约16g）均购自广西中医药大学。

1.4 采样时间

2019年3～5月，每种样本采集4次，每次每种样本分3个采样点，采样时间均为10:00～11:30。

1.5 采样方法

1.5.1 空气样本采用平皿沉降法将普通琼脂培养基平板分别放置于动物栏舍内室中央、料槽边及走道处30min后取出，37℃培养24h[1]。

1.5.2 水样本取动物栏舍近处的池塘水，冲洗栏舍排污水。池塘水从水深约5cm处用灭菌的三角瓶分3个点取水，而栏舍排污水直接用灭菌平皿分3个点取，最后混在一起，置实验室冰箱4℃保存，待检。

1.5.3 土壤样本在动物栏舍围墙外200cm有裸露土壤处取3个有代表性的点，先挖去表土，取深5cm左右的土壤约50g，并且3个点取样量一样，分别置于已灭菌的三角瓶中，置实验室冰箱4℃保存，待检。

1.6 样本处理

空气样本直接放入37℃培养箱培养24h。而水样本和土壤样本都需要预稀释处理。对水样本，吸取1mL水样加入到装有9mL灭菌生理盐水试管中，混匀，按倍比稀释法依次稀释成10－2～10－6浓度水样悬液，取最后3个稀释度各1mL放入灭菌平皿中，倒入预先灭菌冷却到45℃普通琼脂培养基，混匀，每个稀释度做2个平皿，37℃培养48h。对土壤样本，则加入灭菌生理盐水稀释到250mL，摇匀，静置5min，无菌吸取5µL悬液分别接种于血平板、SS平板、麦康凯平板及普通琼脂平板，每种平板2个，一个放入厌氧环境，并与另一个同置于37℃培养箱培养48h。

1.7 细菌分离培养

1.7.1 细菌的分离与纯化接种样本经过37℃培养24～48h后，挑取典型单个菌落进行涂片，革兰氏染色、镜检。再挑取可疑菌株单菌落进行纯化培养，分别接种血平板、肉汤培养基及相应的鉴别培养基，进行培养鉴定。

1.7.2 分离菌株生化鉴定对从3类样本中分离出的14种菌株进行生化鉴定，结果具体见表1。

1.8 细菌鉴定

根据革兰氏染色鉴定结果、鉴别培养基上的菌落培养特征及生化试验鉴定结果对分离菌株进行鉴定[2]。鉴定细菌参照文献[3，4]。

1.9 动物致病性试验

对从环境中分离获得的61株菌株（具体见表2），按常规报道的方法进行小白鼠致病性实验[5]。

将61株分离菌分别接种肉汤培养基，根据不同菌株的培养条件进行培养，然后用灭菌生理盐水稀释，用细菌平板计数法测定并稀释成含菌量为106CFU/mL的新鲜肉汤菌悬液，接种量为0.5mL/只、每株细菌做3个重复。葡萄球菌菌液采用腹部皮下注射，对照组腹腔注射等量的灭菌生理盐水；产气荚膜梭菌菌液采用尾静脉注射，对照组尾静脉注射灭菌生理盐水，10min后全部处死，立即放入37℃恒温箱中培养8～12h[6]；破伤风杆菌要先将分离菌株接种到厌氧肉肝汤培养基，37℃培养箱中培养48h，然后采用后腿肌肉注射，对照组注射灭菌生理盐水；其余的分离菌液全部采用腹腔注射，对照组注射灭菌生理盐水。

接种后观察小白鼠活动变化及发病死亡情况，并对死亡的小白鼠进行剖检，观察各脏器病变，同时取病变部组织涂片及染色镜检并分离鉴定细菌，若结果与注入细菌相同，则判定为病原菌。未发病的继续观察饲养至两周。

表1 可疑菌株生化试验及鉴别培养情况

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定结果

整个试验共采集4批样品，空气样本、水样本及土壤样本各12份，共分离出61株细菌，详见表2。

表2 养殖场环境中细菌的种类情况

2.1.1 空气样本细菌分离鉴定结果经鉴定，从空气样本中分离获得23株细菌，其中革兰氏阳性菌（G+）14株（60.87%），革 兰 氏 阴 性 菌（G-）9株（39.13%），革兰氏阳性菌中以葡萄球菌数量最多，获8株菌，占34.78%（8/23），具体结果见表3。

表3 空气样本中各种细菌检出率

2.1.2 水样本细菌分离鉴定结果经鉴定，从采集的水样本中分离到18株细菌，其中G+菌7株（38.89%），G-菌11株（61.11%）。从水样本中分离到的细菌主要是G-菌，且多数是些条件致病菌，结果见表4。

表4 水样本中各种细菌检出率

2.1.3 土壤样本细菌分离鉴定结果经鉴定，从采集土壤样本中分离到20株细菌，其中G+菌14株（70.00%），G-菌6株（30.00%）。除了常见的细菌外，还分离到一些不常见的细菌如破伤风杆菌和李氏杆菌，结果见表5。

表5 土壤样本中各种细菌检出率

2.2 动物致病性试验

结果表明，部分分离菌株对小白鼠有致病性，致病性菌株占菌株总数的36.07%。61株分离菌中有些致病力强，有些无致病性，致病率比较高的是产气荚膜 梭菌、破伤风杆菌、李氏杆菌及沙门氏菌，结果见表6。

表6 环境细菌致病性试验结果

3 讨论与结论

本次试验从3类样本中共分离出14种细菌，61个菌株，其中革兰氏阴性菌26株（42.62%），革兰氏阳性菌35株（57.38%）。空气样本检出7种细菌，共23株细菌，以葡萄球菌居多，占34.78%（8/23）；水样本共分离出11种细菌，以G－检出率最多,共分离出11株,占61.11%（11/18）；土壤样本分离出9种细菌，除常见细菌外，还分离到破伤风杆菌和李氏杆菌，应引起高度重视，并且葡萄球菌和大肠杆菌检出率最多（15.00%）。在所采集的3种环境样品中，以葡萄球菌分离率最高，占19.67%（12/61），说明葡萄球菌为环境的主要污染菌，提示外科手术及创伤处理时应遵守无菌操作原则，使用敏感抗菌药物预防术后感染，平时要加强对粪污、废弃物及病死动物尸体进行无害化处理，要加强周围环境的消毒。小白鼠致病性试验结果显示，61株分离菌中有36.07%（22/61）菌株有致病性，39株没有致病性，表明养殖场环境中的细菌种类多样且存在大量的致病菌，提示养殖实训场要注意做好细菌性疾病的防治工作，平时要保持动物栏舍清洁干燥，定期监测环境中的细菌种类，定期消毒，特别是气温变化、环境潮湿时更要严格消毒，并轮换使用不同品牌不同类别的消毒药。

此次调查还发现，致病菌中有1株是蜡样芽孢杆菌，提示应重视当蜡样芽孢杆菌用作益生菌时的安全性检测，以防止致病性蜡样芽孢杆菌的潜在危害。此外，在分离到的致病菌中有4株是产气荚膜梭菌，此菌形成芽胞后对环境因素及消毒药抵抗力较强，在自然界长期存活，感染途径主要是通过消化道，提示平时要搞好环境卫生和保证饲料、饮水的清洁，以预防本病发生。

本次试验采集的样本是在鸡、牛的栏舍进行取样，采集样本有一定的局限性，其它如猪、马动物舍细菌污染情况怎样，致病性情况如何，需要日后有待进一步的探究。