黄芩苷通过调控c-Myc介导的细胞周期抑制胆管癌细胞增殖

徐杨，肖斌，魏嵋，代荣阳，向远彩△

胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一种恶性胆管上皮性瘤［1］。近年来，CCA 的发病率在全球范围内逐步攀升［2］。目前，手术切除是临床治疗CCA的主要手段，但仅对早期患者有效。由于胆管特殊的解剖学位置、检测手段局限以及发病隐匿等因素，导致大部分患者发病时已处于不宜手术的中晚期，所以局部或全身化疗仍是这类人群的主要治疗方式。目前，化疗对CCA的治疗效果不甚理想，因此，亟待寻找新的治疗CCA的有效方法。

天然药物对机体的不良反应小，且具有抗肿瘤细胞突变、促进肿瘤DNA损伤以及抑制肿瘤细胞增殖等特点，在治疗肿瘤方面具有较大的潜力，近几年逐渐成为抗肿瘤领域的研究热点［3］。黄芩苷（Baicalin，BC）又名贝加灵，是从植物黄芩的根中提取的一种重要的黄酮类化合物［4］，对肝癌、胃癌和乳腺癌等肿瘤具有显著的抑制作用［5］。深入研究发现，BC 可通过降低肿瘤细胞转移抑制肿瘤生长［6］。然而，BC对CCA的作用及机制尚不明确。本研究以人源CCA 细胞QBC939 和RBE 为研究对象，探究黄芩苷对CCA细胞增殖的影响及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 CCA细胞QBC939和RBE（北纳创联生物科技有限公司，中国）；RPMI-1640 培养基（Gibco 公司，美国）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；黄芩苷单体（Sigma-Aldrich公司，德国）；CCK-8试剂盒、细胞周期与凋亡检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L 链霉素混合溶液（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；0.2 μm 硝酸纤维素膜（GE Healthcare 公司，英国）；兔抗周期素依赖激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor，p27）单克隆抗体、兔抗细胞周期蛋白D1（cyclin protein D1，Cyclin D1）单克隆抗体、兔抗原癌基因蛋白质（proto-oncogene proteins，c-Myc）单克隆抗体、鼠抗内参β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及山羊抗鼠 IgG 二抗、RNA 干扰阴性对照（siRNA-Negative Control，si-NC）及 c-Myc 干扰 RNA（siRNA-c-Myc，si-c-Myc，货号6552S，Cell Signaling Technology 公司，美国）；Lipofectamine™3000转染试剂盒（赛默飞公司，美国）；多功能酶标仪（伯腾仪器有限公司，美国）；流式细胞仪（BD Bioscience公司，美国）；红外成像仪（Odyssey公司，美国）。

1.2 细胞培养及干预 将QBC939 和RBE 细胞置于37 ℃恒温培养箱（95%湿度，5%CO2）中，并用RPMI-1640 完全培养基（10%胎牛血清+1%青霉素和链霉素溶液）培养，取对数生长期细胞，将其接种于60 mm 培养皿中生长，当细胞汇合度达到80%时进行实验。黄芩苷单体经二甲基亚砜（DMSO）稀释至200 mmol/L后，放置-20 ℃储存。药物处理时，弃掉培养皿中的培养基，更换为含相应浓度黄芩苷的新鲜培养基，然后置于培养箱24 h后提取蛋白进行后续实验。

1.3 CCK-8法检测CCA细胞增殖活性 参照CCK-8试剂盒说明书，96孔板中接种细胞悬液（每孔100 μL，约1×104个细胞），置于恒温培养箱中培养24 h。（1）黄芩苷对CCA 细胞增殖活性影响实验。设置空白对照组（仅含培养基）、对照组（0 μmol/L 的黄芩苷）和6 个实验组（12.5、25、50、100、200、400 μmol/L黄芩苷），每组设置4个复孔，随后用完全培养基将黄芩苷母液稀释成相应浓度，并以100 μL/孔替换实验组原培养基。（2）敲低c-Myc 对CCA 细胞增殖活性影响实验。设置空白对照组、对照组（si-NC）和3 个实验组（BC、si-c-Myc、BC+si-c-Myc），根据组别分别使用BC和si-c-Myc处理细胞。待培养24 h 后，弃掉培养基，每孔加入100 μL 检测混合液（90 μL 培养基+10 μL CCK-8 溶液），置于37 ℃温育2 h。在酶标仪上设置对应孔位，读取450 nm的吸光度（A）。计算细胞存活率（%）=［A（实验）-A（空白）］/［A（对照）-A（空白）］×100%。并绘制生长柱状图。实验重复3次。

1.4 显微镜观察细胞生长 6 孔板中接种细胞悬液（每孔2 mL，约2×105个细胞），置于恒温培养箱24 h，待细胞汇合度达70%时，用 50、100 和 200 μmol/L 黄芩苷培养 24 h 后，在高倍显微镜下观察细胞生长状态并拍照。

1.5 流式细胞术检测细胞周期 用DMSO（0.1%）和黄芩苷（200 μmol/L）处理QBC939 和 RBE 细胞24 h 后，弃掉原培养基，用预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗2 次。然后加入适量胰酶消化液，数秒后，用适量的完全培养基终止消化，并将细胞收集到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入1 mL 预冷的PBS 后离心，重复清洗2 次，去除残留的胰酶。随后加入适量预冷的70%乙醇，轻轻吹打细胞。置于-20 ℃固定过夜。次日，经1 000 r/min离心5 min后弃上清，用预冷的PBS 清洗2 次去除残留乙醇，然后按照试剂盒细胞周期检测的操作步骤操作并上机检测。实验重复3次。

1.6 细胞转染 当QBC939 和RBE 细胞生长到70%汇合度时，用Lipofectamine 3000转染试剂瞬时转染si-NC、si-c-Myc（50 nmol/L），8 h 更换含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液继续培养16 h，再用200 μmol/L的黄芩苷处理细胞。

1.7 蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测p27、Cyclin D1及c-Myc蛋白表达 用RIPA细胞裂解液裂解细胞，超声破碎3次（5 s/次），随即冰上放置30 min，12 000 r/min 离心15 min。取上清，采用BCA 法进行蛋白定量。取等量的蛋白样品（50 μg），并加入1/3体积的蛋白上样缓冲液，涡旋混匀后，放置金属浴中100 ℃变性10 min，然后置于冰上冷却。将制备好的样品用10%十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白（80～120 V），随后湿转至硝酸纤维素膜（NC）上，并用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后用0.5%TBST清洗3次（5 min/次）。截取不同位置的条带并用相应的蛋白一抗，p27（1∶2 000）、Cyclin D1（1∶2 000）、c-Myc（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000），于4 ℃孵育过夜。待孵育完成后，用TBST 清洗3次（每次5 min），随后分别加入相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000），在室温避光孵育1 h。最后再用TBST 清洗3 次，并用Odyssey 红外成像系统显色曝光。各条带的灰度值用Image J软件进行分析。实验重复3次。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0统计软件分析完成。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷抑制CCA 细胞增殖活性 CCK-8 实验结果显示，与 0 μmol/L 组相比，12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 黄芩苷处理组的 QBC939 和 RBE 细胞的存活率降低，见图1A、B。在高倍显微镜下观察发现，随着黄芩苷处理组浓度的增加，QBC939 和RBE 细胞的生长速度明显变缓，这在200 μmol/L 处理组中尤为明显，见图1C、D。由此，选取200 μmol/L黄芩苷作为后续实验的给药浓度。

2.2 黄芩苷阻滞CCA 细胞的细胞周期 流式细胞术结果显示，与0 μmol/L组相比，200 μmol/L黄芩苷处理细胞24 h后，QBC939细胞的S期细胞比例明显增加，但对RBE细胞周期没有明显影响，见图2A、B。Western blot 进一步检测发现，黄芩苷可显著性下调S 期辅助性的周期蛋白Cyclin D1，并上调周期素依赖激酶抑制剂p27的蛋白水平，见图2C、D。

2.3 黄芩苷抑制c-Myc 蛋白表达 Western blot 结果显示，与 0 h 组相比，12 h 和 24 h 200 μmol/L 黄芩苷处理QBC939和RBE 细胞后可显著降低c-Myc 的蛋白表达，且处理时间越长，抑制作用越明显，见图3A、B。此外，不同浓度的黄芩苷处理细胞24 h后，与0 μmol/L 组相比，50、100、200 μmol/L c-Myc 的蛋白表达明显减少，见图3C、D。

2.4 黄芩苷通过抑制c-Myc 降低CCA 细胞增殖活性 Western blot结果显示，与对照组相比，用siRNA敲低QBC939和RBE细胞中的c-Myc后，p27蛋白的表达水平明显增加，同时Cyclin D1 显著下调，这与黄芩苷处理时的变化一致。此外，与单独的黄芩苷处理组相比，敲低c-Myc 联合黄芩苷处理后，p27 蛋白的表达显著增加，Cyclin D1 蛋白的表达明显减少（均P＜0.05），见图4A、B。并且，细胞增殖活性检测也发现，单独敲低c-Myc 后可明显抑制QBC939 和RBE 细胞的存活率；敲低c-Myc 与黄芩苷联用时，2种细胞的存活率（%）与单独敲低c-Myc组相比均进一步降低（均P＜0.05），见图4C、D。

3 讨论

Fig.1 Effectsofbaicalinontheproliferationofcholangiocarcinomacells图1 黄芩苷对胆管癌细胞增殖的影响

3.1 CCA 的研究现状 CCA 是一种胆管上皮的恶性实体瘤，起病隐匿，且易发生转移［7］。CCA的发病机制常与年龄偏高、胆管结石、慢性胆管炎、肝炎、肝硬化、吸烟、化学毒素及寄生虫感染等相关［8］。当前最常用的化疗手段是顺铂与吉西他滨联合治疗，但大范围使用不仅会引起肿瘤耐药性，而且对患者肝肾等器官有较大的损害。即便如此，患者的平均生存期仍不超过21.4个月［9］。本文探究了天然黄酮类化合物黄芩苷对CCA 细胞的作用，结果显示黄芩苷能显著抑制2种CCA细胞的增殖活性。

Fig.2 Effects of baicalin on the cell cycle of cholangiocarcinoma cells图2 黄芩苷对胆管癌细胞周期的影响

Fig.3 Effects of baicalin on the expression of c-Myc protein of cholangiocarcinoma cells图3 黄芩苷对胆管癌细胞中c-Myc蛋白表达的影响

Fig.4 Effects of baicalin on the protein expression of cell cycle and survival rate through inhibiting the protein expression of c-Myc图4 黄芩苷抑制c-Myc蛋白表达对周期蛋白表达及细胞存活率的影响

3.2 黄芩苷阻滞CCA细胞周期 镜下观察到黄芩苷可抑制CCA 细胞生长，提示黄芩苷可能抑制细胞周期进程。本研究采用Western blot检测周期相关蛋白，发现黄芩苷可调节Cyclin D1与p27的蛋白表达水平，提示黄芩苷可能阻滞CCA 细胞周期。早期的研究揭示Cyclin D1 与S 期进程受阻有关［10］。为进一步明确黄芩苷对CCA细胞周期的影响，本研究流式细胞术结果显示，黄芩苷处理后QBC939细胞的S期细胞比例增多。上述结果表明Cyclin D1 及p27 蛋白的改变可能与S 期的阻滞有关，这与 Zhu 等［11］报道的黄芩苷下调 Cyclin D1 导致人胶质母细胞瘤细胞U87 和U251 的细胞周期S期停滞的结果相似。此外，流式细胞术结果显示，黄芩苷不影响CCA 细胞S 期向G2 期过渡，而是促进QBC939细胞由G1期进入S期，对RBE细胞周期进程无影响，这可能与2种细胞的遗传背景不同有关［12］。然而，黄芩苷处理后2种细胞的增殖活性下降，推测黄芩苷可能通过调控如S期激酶相关蛋白2等使处理的细胞过早地由G1期进入S期，从而导致细胞内的功能紊乱，最终抑制细胞增殖［13］。以上结果说明黄芩苷可通过调控周期相关蛋白影响CCA细胞的周期进程。

3.3 黄芩苷通过下调c-Myc蛋白表达调控CCA细胞周期蛋白 细胞内如c-Myc 等一系列重要的癌基因在细胞生长的调控中起重要作用。本研究显示，敲低c-Myc后影响了周期蛋白Cyclin D1与p27的表达，且显著抑制细胞增殖，这提示黄芩苷确实可以通过c-Myc 调控CCA 细胞周期。已有研究表明c-Myc 的下调可降低QBC939 细胞的体外侵袭性［14］。近期研究也显示，用c-Myc辅助转录激活因子抑制剂JQ1 抑制c-Myc 的功能后可有效地阻止CCA 异种移植瘤的生长［15］。本课题组前期实验也发现 CCA 的发生与 c-Myc 蛋白失调密切相关［16］。这些证据提示c-Myc 可能是黄芩苷抑制CCA 细胞增殖的靶基因，但黄芩苷如何下调c-Myc，以及体外针对CCA 治疗的效果如何等方面仍不明确，有待进一步研究。

综上所述，黄芩苷可通过下调c-Myc调控CCA细胞周期蛋白，进而降低细胞增殖活性，这将为寻找CCA治疗的新方法提供理论依据。