肝脏CD4、CD8及CD68表达与Kasai术后胆管炎的关系研究

葛亮，苟庆云，赵金凤，高伟，詹江华

胆管炎是胆道闭锁肝门-空肠吻合术（Kasai术）后最常见且最严重的并发症，发生率高达60%～90%，严重影响患儿的自体肝生存时间［1-3］。胆管炎的病理基础包括胆管的萎缩、消失和坏死，但Kasai术后胆管炎的特征性改变却鲜有报道。既往研究表明Kasai 术时肝组织的炎症浸润程度可以作为预测Kasai 术后胆管炎发生的指标之一［4］；CD8+细胞比例降低，CD4+/CD8+细胞比值升高以及CD68+细胞比例下降，提示患儿预后较差［5］。由于临床上不主张应用有创性的肝组织活检来诊断Kasai术后胆管炎，因此目前缺乏胆管炎发作时肝脏组织病理学改变，CD4、CD8 及CD68 表达的研究。本研究拟通过对Kasai术后胆管炎的病理学研究，探讨肝脏CD4、CD8及CD68 表达与胆管炎的关系，以期为Kasai 术后胆管炎的诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年5月—2018年11月于天津市第一中心医院完成肝移植手术的胆道闭锁患儿27 例，其中男12 例，女15 例，年龄4.6～8.2 个月，平均（6.4±1.0）个月。所有患儿既往均于天津市儿童医院普外科行胆道造影及肝组织活检确诊为胆道闭锁，并行Kasai术。10例患儿因Kasai术后频发胆管炎而行肝移植手术（频发胆管炎组），男6 例，女4例；年龄 4.6～8.2 个月，平均（7.0±1.1）个月。17 例患儿因Kasai 术后黄疸未消退及肝功能衰竭而行肝移植手术，其中既往未发生胆管炎者10例（无胆管炎组），男4例，女6例；年龄4.9～7.8个月，平均（6.1±0.8）个月；既往发生早期胆管炎者7例（早期胆管炎组），男2例，女5例；年龄5.2～6.7个月，平均（6.2±0.6）个月。本研究经天津市儿童医院及天津市第一中心医院伦理委员会批准，标本取材经家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 胆管炎诊断标准 排除其他疾病或原因无法解释的高热；皮肤巩膜黄染加重或退后反复出现；大便颜色变浅或再次出现陶土色；血清总胆红素（total bilirubin，TBil）与直接胆红素（direct bilirubin，DBil）升高；血常规提示C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）及中性粒细胞升高［3］。术后1个月内发生的胆管炎为早期胆管炎；术后半年内胆管炎发作次数≥3次为频发胆管炎。

1.3 方法

1.3.1 资料收集 收集患儿肝移植术前的临床资料，包括性别、年龄、Kasai手术年龄、自体肝生存时间、肝移植术前白细胞计数（white blood cell，WBC）、CRP、肝移植术前肝功能指标［白 蛋 白（albumin，ALB）、丙 氨 酸 转 氨 酶（alanine aminotransferas，ALT）、天 冬 氨 酸 转 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）、DBil、碱 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyl transferas，GGT）］，以及胆管炎发生情况。

1.3.2 肝组织标本处理 取患儿肝移植时病肝的肝门部肝组织，经10%福尔马林溶液固定，8～24 h后经石蜡包埋储存，所有过程均处于同一实验条件。

1.3.3 HE染色 病理切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗，苏木素浸染5 min，经酸化伊红乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脱水，透明剂浸泡至透明，中性树胶封片等一系列操作。在光学显微镜下观察肝纤维化、胆管增生、肝组织炎性细胞浸润程度及胆栓情况等。肝纤维化分级标准（METAVIR 分级标准［6］）：F0，无纤维化；F1，肝汇管区轻度纤维化；F2，邻近汇管区轻度桥接纤维化；F3，伸向邻近汇管区重度桥接纤维化；F4，肝硬化、假小叶形成。胆管增生分级标准［7］：0 级，平均每个视野＜5 个增生胆管；1 级，平均每个视野为5～9 个增生胆管；2 级，平均每个视野≥10 个增生胆管；3 级，2 级的基础上增生胆管形态扭曲异常、细小等表现。炎性细胞浸润分级标准：计算汇管区炎性细胞数目（N）与细胞核总数（T）的比值（I）；1 级，I＜25%；2 级，25%≤I＜50%；3 级，50%≤I＜75%；4 级，I≥75%。胆栓分级标准［8］：1 级，汇管区无胆栓；2级，仅几个汇管区的少量胆管有胆栓；3级：每个汇管区的少量胆管存在胆栓；4 级：几乎所有汇管区的全部小胆管存在胆栓。

1.3.4 免疫组化染色 病理切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复15 min，冷却至室温，PBS 冲洗5 min×3 次，于3%H2O2中37 ℃孵育10 min，用PBS 冲洗5 min×3 次，滴加一抗（兔抗人CD8 单克隆抗体、小鼠抗人CD4、CD68 单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司），于冰箱中4 ℃过夜，次日取出置于室温30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠IgG聚合物，北京中杉金桥生物技术有限公司）后37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min×3 次，经DAB（试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司）显色5～10 min，镜下（×100）观察染色情况，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片。免疫组化阳性标准：根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）。切片内读取任意5 张视野，用同一计算机成像系统留取相同倍数显微镜下图片，采用ImagePro Plus 6.0 自动分析系统（美国 Media Cybernetics 公司）进行半定量分析，计算CD4、CD8、CD68 蛋白的平均光密度（AOD）值。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 20.0 软件进行统计处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。多组间率的比较采用R×C列联表资料的χ2检验，组间多重比较采用Brunden 法进行显著性水平校正。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者一般资料比较 3 组患儿的性别、年龄、Kasai手术年龄及自体肝生存时间差异均无统计学意义，见表1。3 组肝移植术前WBC、CRP 及肝功能指标差异均无统计学意义，见表2。频发胆管炎组中有4 例患儿入院时存在胆管炎，肝移植前经抗感染及抗炎治疗后，体温恢复正常，CRP降低，其中3例患儿WBC较治疗前好转，而肝功能指标无明显改善，见表3。

Tab.1 Comparison of general data of children between three groups表1 3组胆道闭锁患儿一般资料比较

2.2 HE染色结果 3组患儿肝移植时肝纤维化、胆管增生和胆栓分级差异均无统计学意义。频发胆管炎组肝组织汇管区可见大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，肝窦间隙也可见散在的炎性细胞浸润；其炎性细胞浸润程度较无管炎组和早期胆管炎组严重，见表4、图1。

2.3 免疫组化染色结果 CD4 蛋白在汇管区及肝小叶周边呈阳性表达，呈棕黄色（图2）；CD8 蛋白主要在汇管区呈强阳性表达，呈棕褐色（图3）；CD68蛋白在汇管区和肝窦间隙均呈强阳性表达，呈棕褐色（图4）。3 组间CD4 蛋白的表达水平差异无统计学意义；频发胆管炎组CD8、CD68 蛋白表达水平均高于无胆管炎组和早期胆管炎组（P＜0.05），见表5。

Tab.2 Comparison of hematological parameters between the three groups of children表2 3组胆道闭锁患儿血液学指标比较

Tab.3 Changes of hematological parameters before and after treatment in 4 children with cholangitis表3 4例胆管炎患儿治疗前后血液学指标改变情况

Tab.4 Comparison of pathological results in each group of children with biliary atresia表4 各组胆道闭锁患儿病理结果比较

Fig.1 Comparison of inflammatory cell infiltration between the three groups(HE，×100)图1 3组肝组织标本炎性细胞浸润程度比较（HE，×100）

Fig.2 The expressions of CD4 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)图2 3组肝脏组织标本中CD4的表达情况（免疫组化染色，×100）

Fig.3 The expressions of CD8 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)图3 3组肝脏组织标本中CD8的表达情况（免疫组化染色，×100）

Fig.4 The expressions of CD68 in liver tissues of three groups(immunohistochemical staining，×100)图4 3组肝脏组织标本中CD68的表达情况（免疫组化染色，×100）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3组胆道闭锁患儿CD4、CD8及CD68蛋白的表达 （AOD，）

Tab.5 Expressions of CD4，CD8 and CD68 proteins in three groups表5 3组胆道闭锁患儿CD4、CD8及CD68蛋白的表达 （AOD，）

＊P＜0.05；a与无胆管炎组比较，b与早期胆管炎组比较，P＜0.05

组别无胆管炎组早期胆管炎组频发胆管炎组F n 10 7 10 CD4 0.099 0±0.016 7 0.104 2±0.022 3 0.114 6±0.014 7 2.028 CD8 0.188 4±0.031 3 0.198 1±0.036 1 0.233 8±0.036 6ab 4.651＊CD68 0.160 7±0.019 0 0.165 4±0.013 3 0.190 2±0.024 0ab 6.151＊

3 讨论

Kasai术是目前治疗胆道闭锁的首选治疗方式。胆管炎是胆道闭锁Kasai 术后最常见的并发症，且Kasai术后一旦发生胆管炎，其反复发作的概率高达90%［9］。反复发作胆管炎将对肝脏造成持续性损害，加速肝硬化过程，导致自体肝生存时间缩短［10-11］。术后胆管炎的防治是保证胆道闭锁治疗成功的关键环节。目前胆道闭锁术后胆管炎的发病机制仍不明确，可能与肝内胆管发育障碍及胆管损伤、肠道微生物迁移、肠道内容物反流及肝门部淋巴回流障碍等因素相关。术后胆管炎的诊断基于患儿的临床表现及血液学指标检查，国内尚未见开展肝穿刺活检病理检查证实胆管炎发作的研究，且缺乏胆管炎治疗效果的评价标准［12］。

有研究显示，Kasai术可使肝内部分有功能的胆管在一定程度上引流胆汁，缓解肝内胆汁淤积，减轻炎症反应，进而降低炎症对胆管的损伤［13］。但胆管炎发作时可导致胆管的萎缩、坏死和消失。免疫细胞在小胆管周围的浸润及胆管上皮细胞的坏死可导致部分胆管阻塞。反复发作胆管炎患儿肝内胆管增生严重，汇管区胆栓形成，肝细胞可见淤胆，炎性细胞浸润严重［8］。胆管炎发作越频繁，其肝内炎症越明显［14］。本研究行HE 染色示频发胆管炎组患儿存在严重的肝纤维化、胆管增生、胆栓程度及炎性细胞浸润，与以上研究一致。但肝纤维化、胆管增生及胆栓程度与无胆管炎组和早期胆管炎组无明显差异，考虑原因是这3种指标均为胆道闭锁患儿肝脏终末期改变，而并非胆管炎的特征性改变。频发胆管炎组汇管区炎性细胞浸润程度明显高于无胆管炎组和早期胆管炎组，提示汇管区炎性细胞浸润是胆管炎的特征性表现，其中淋巴细胞浸润在胆管炎的发作中起重要作用。

有研究表明，免疫系统参与胆道闭锁的发病，肝内胆管周围T淋巴细胞浸润是胆道闭锁的病理学特征，CD4+和CD8+T细胞是其主要的细胞类型，主要分布于汇管区［15］。CD68 是巨噬细胞/单核细胞的标志，肝脏中的巨噬细胞（即Kupffer细胞）主要存在于肝窦中［16-17］。CD8+T 细胞的特异性免疫反应参与胆管上皮细胞的损伤，在胆道闭锁肝纤维化中发挥重要作用［18］。研究表明，胆道闭锁患儿肝组织中均有CD4+、CD8+细胞浸润，它们不仅可围绕小胆管周围形成袖套样结构，在与汇管区相邻的肝窦内往往呈团状聚集现象，邻近汇管区的肝细胞也有明显的胞浆疏松化、水肿变性等病理改变。胆道闭锁患儿肝组织和纤维斑块存在CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润，手术吻合部位存在炎症反应，这可能是术后胆管炎的发病基础［19］。有研究发现Kasai 术时肝组织中CD8+T 细胞浸润减少是术后胆管炎发生的危险因素，可能与CD8+T 细胞不具有细胞毒性作用但仍存在免疫调节作用有关［20］。本研究结果显示，频发胆管炎组CD8、CD68蛋白表达水平均高于无胆管炎组和早期胆管炎组，提示胆管炎发作时炎性细胞种类及数量发生改变，可能与细菌或病毒介导的炎症反应相关。

胆管炎的主要治疗药物包括抗生素、激素和利胆药物，临床上对于胆管炎的治疗更多依赖于经验用药。患儿体温恢复正常、黄疸消退、粪便颜色变深等常被视为胆管炎治疗有效，但是肝脏的病理改变是否恢复正常却无从考证。本研究频发胆管炎组中有4 例患儿入院时就存在胆管炎发作，肝移植前经抗感染及抗炎治疗后，血常规中的炎症指标较前明显好转，肝功能变化不显著，但是肝脏仍然存在严重的炎性细胞浸润，提示胆管炎可成为Kasai术后慢性迁延性疾病，其反复发作加重肝纤维化，导致肝功能衰竭。

肝组织活检因其有创性在临床胆管炎诊断及疗效评价中的应用受到了很大限制。虽然未能选取胆管炎发作时的肝组织标本是本研究的不足之处，但是因频发胆管炎而行肝移植患儿的标本能够部分表现出胆管炎的病理改变，仍具有一定的研究价值。未来期待通过胆管炎的病理改变研究，建立一种简便、安全、有效的检查标准来评估胆管炎的预后和转归。

综上所述，Kasai术后胆管炎肝脏病理改变主要为汇管区炎性细胞浸润，是CD8+T细胞和CD68+肝巨噬细胞参与的炎症反应。对于反复发作的胆管炎，是否应延长抗感染及抗炎的治疗时间有待进一步研究验证。