肉牛支原体病原分离鉴定及药物敏感性试验

杨 莉， 姜玲玲， 张 涛， 吴位珩*， 徐景峨， 余 波， 刘 镜， 杨茂生， 孙启跃， 冯明祥， 刘 和， 邹茂华

(1.贵州省农科院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州省关岭自治县畜牧服务中心，贵州 关岭 561300；3.思南畜牧技术推广站，贵州 铜仁 565100；4.黔西县农业农村局，贵州 黔西 551500)

牛支原体是危害养牛业的一种重要的致病性病原，无细胞壁，介于细胞和病毒之间。致病性支原体除能导致牛肺炎、乳腺炎、关节炎外，还导致眼结膜炎、耳炎、生殖道炎症与不孕等多种疾病[1]。1961年，美国人Hale[2]首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到牛支原体，该病原在世界范围内普遍存在。自2008年以来，我国大部分省(地区)从外地引入肉牛爆发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，多数牛在运输到目的地后1～2周发病，发病率为20%～100%，病死率高达10%～50%，给我国肉牛养殖业造成了巨大的经济损失[3]。随着贵州扶贫攻坚的开展，肉牛引进量不断增大，带来了一系列流行病的感染、发生，肉牛运输综合征最为突出，而牛支原体病是引起牛运输综合征的主要病因，给贵州省养牛业造成巨大经济的损失，为此项目组对牛支原体病在贵州省的流行情况进行调查，并对牛支原体病原进行分离鉴定、生物学特性、分子诊断及药物敏感性研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验样本 无菌采集疑似感染牛支原体病牛的鼻拭子和病死牛肺。

1.1.2 参考菌株 牛支原体菌株由华中农业大学动物医学院惠赠。

1.1.3 引 物 引物序列为：上引物，5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′；下引物，5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.1.4 生化试剂 PPLO肉汤培养基、PPLO固体培养基(青岛高科技工业园，海博生物技术有限公司)；特级马血清、酵母粉、精氨酸(北京索莱宝科技有限公司)；Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)；Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、EDTA、Tris-HCL、琼脂糖、DL2000Marker、2×TaqPCRMasterMix(10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.05 U Poymerase/μL)、去离子水(天根生化科技[北京]有限公司)；细菌微量生化鉴定管(青岛高科技工业园，海博生物技术有限公司)；药敏试纸(杭州滨和微生物试剂有限公司)。

1.1.5 主要仪器 石蜡切片机(Leica RM2125，德国)；高通量快速研磨仪(海净信实业发展有限公司)；Lab-Aid 820核酸提取仪(厦门百维信生物科技有限公司)；电子天平(美国奥豪斯AR2140)；高速冷冻离心机(美国赛麦飞SORVALL：LEGEND MICRO 21R)；梯度PCR扩增仪、电泳仪、紫外透射仪、凝胶成像仪(德国BIOMETRA)；紫外分光光度计：北京普析(TU-1810SPC)。

1.2 方 法

1.2.1 样本采集 2018年采自黔西县牛场患病牛的鼻拭子和死亡牛肺。无菌采集疑似牛支原体肺炎病死牛肺，或采用棉签采集疑似牛支原体肺炎鼻涕(鼻拭子)，用冷藏箱带到实验室，冷藏备用。

1.2.2 组织样本固定 将病死牛肺用生理盐水清洗后，置10%的甲醛溶液中固定，待进行组织病理切片的制备。

1.2.3 病原分离培养 鼻拭子分离培养：取1 mL生理盐水将鼻拭子浸润，尽量将药棉棒上的鼻涕清洗在试管里，弃去药棉棒，采用孔径为0.45 μm滤膜过滤上述溶液后接种于PPLO肉汤培养基中，5% CO2、37 ℃恒温分别培养24，48，72 h，观察培养基的颜色及培养液絮状物的变化情况，如果由红变黄，有絮状物出现，转接于PPLO固体培养基中，5% CO2、37 ℃恒温培养48 h以上，同时取1 mL培养液置于1.5 mL的离心管中，以备提取病原菌DNA。

病死牛肺分离培养：采用生理盐水将采集到的牛肺冲洗，将肺置于平皿中，用手术剪刀取中间没有污染部分，进行组织研磨，采用孔径为0.45 μm滤膜过滤后接种于PPLO肉汤培养基中，5% CO2、37 ℃恒温培养24，48，72 h，观察培养基的颜色及培养液絮状物的变化情况，如果由红变黄，有絮状物出现，可转接于PPLO固体培养基中，5%CO2、37 ℃恒温培养48 h以上，同时取1 mL培养液置于1.5 mL离心管中，以备提取病原菌DNA。

1.2.4 组织病理切片制备 将置10%的甲醛溶液中固定1周的肺、组织，进行酒精脱水和二甲苯透明，脱水时间从低浓度到高浓度(见表1)，接着让石蜡充分渗入到肺组织中，使组织结实，有利于连续切片。然后进行常规切片，染色，并在显微镜下观察，记录组织结构变化。

表1 肺组织脱水步骤

1.2.5 生化反应试验 按常规操作将分离的16株菌株(HZ株、25025株、J89310、J7、J9、J23、J31、J39、J40、J41、W25、W28、W44、W69、W77、W88)，接种于细菌微量生化鉴定管中(购自青岛海博生物技术有限公司)，5%CO2、37 ℃恒温培养48～72 h，观察结果并记录。

1.2.6 PCR检测与鉴定 组织样本肺DNA提取：取样本肺少许，采用高通量快速研磨仪研磨，加入900 μL生理盐水，反复冻融3次，然后5 000 r/min离心5 min，取700～900 μL上清液，加入20 μL蛋白酶K，100 μL 10% SDS液，55 ℃水浴箱中加热30 min至组织消化完全，取出冷却。采用核酸提取Mini试剂盒提取所需DNA模板。

样本鼻拭子DNA提取：用1 mL ddH2O将鼻拭子完全浸润，尽量将药棉棒上的鼻涕清洗在试管里，弃去药棉棒，将试管里的溶液全部移入1.5 mL的离心管中，10 000 r/min离心2 min，弃上清，收集沉淀。采用核酸提取Mini试剂盒提取所需DNA模板。

分离培养菌株DNA提取：取培养菌液1 500 μL于2 mL的离心管中，10 000 r/min离心2 min，弃上清，收集沉淀。采用核酸提取Mini试剂盒提取所需DNA模板。

PCR扩增条件：采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下进行扩增。反应体系和条件：PCR酶为10 μL，支原体标准菌株DNA模板2 μL，样本DNA模板2 μL，上下引物各1 μL，加入ddH2O至25 μL，在Tgradient96扩增仪下进行如此循环：94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，52℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。反应结束后将扩增产物取5 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物鉴定：牛肺炎支原体的PCR扩增片段经胶回收，送上海生工宝生物工程有限公司测序，并将测序结果在NCBI中进行病原菌的鉴定和同源性的比对。

1.2.7 药物敏感性试验 分别将分离到的菌株采用消毒过的药棉棒，蘸取100 μL菌液，均匀地涂布于PPLO固体培养基上，再将药敏试纸置于均匀涂布有菌液的固体培养基上，每个培养基一般放置7～9张药敏试纸，然后5% CO2、37 ℃恒温培养1～2 d，观察并记录抑菌圈直径的大小，并判断药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 发病牛临床症状

发病牛临床症状主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲减退、被毛粗乱、咳嗽、气喘、流黏性或脓性鼻液、拉稀、血便、关节炎、结膜炎、极度消瘦，甚至衰竭死亡。解剖后死亡牛肺部有干酪样坏死灶或化脓性坏死灶，胸腔内有大量纤维性渗出液或脓性液体，有些出现肺与胸腔粘连，以及消化道溃疡等。

2.2 病原菌的分离培养结果

2018年6月，项目组自黔西隔离场采集引进能繁母牛疑似病牛鼻拭子样本163份，死亡牛肺样本1份，检测出60份牛支原体阳性样本，分离培养出18株形态特征和生长特性与牛支原体相符的菌株。分离的菌在PPLO液体培养基中培养72 h后，液体PPLO培养液开始变色；分离传代培养时，液体变色时间缩短，只需要24 h就可由红变黄。在PPLO固体培养基上培养5%CO2、37℃恒温培养72 h后，可见针头大小不一的菌落(图1)，在普通光学显微镜下可看到菌落呈圆形，边缘整齐，具有典型的“油煎蛋”状菌落(图2)。

图1 PPLO固体培养基上针头大小不一的菌落

图2 显微摄影下典型的“油煎蛋状”形态(40×)

2.3 组织病理切片结果

牛患支原体肺炎后，往往并发其他病原菌感染，使病牛病情加重，甚至造成死亡，因此不仅仅肺部发生病理变化，其他器官也随着病情的变化发生病变，具体的病理变化由图3(a-1和a-2)肺组织病理切片结果可见，肺间质动脉血管充血、肺间质水肿变宽，呈灰白色；肺间质纤维增生，有实质性病变；肺泡上皮细胞变性坏死；肺泡内有大量粘液。由图3(b-1和b-2)肝组织病理切片结果可见，肝小叶中央静脉瘀血，间质中央动脉充血，肝上皮细胞脂肪变性和颗粒变性；间质中炎症细胞增生。由图3(c-1和c-2)淋巴组织病理切片结果可见，牛淋巴结皮质和髓质结构不清，髓质间水肿，淋巴小结的生发中心淋巴细胞活化，淋巴细胞增生。由图3(d)的心组织病理切片结果可见，牛心肌颗粒变性，肌纤维之间水肿。由图3(e)脾组织病理切片可见，牛脾脏白髓内淋巴小结活化，淋巴细胞增生，红髓内淋巴细胞增生，脾索之间水肿。

注：a-1和a-2为肺组织；b-1和b-2为肝组织；c-1和c-2为淋巴组织；d为心组织；e为脾组织。

2.4 生化试验结果

常规操作将分离的菌株接种于细菌微量生化鉴定管中，由结果(表2)可知：所有菌株对酚红葡萄糖肉汤、七叶苷呈阳性反应，对明胶、L-精氨酸双水解酶、尿素酶呈阴性反应；HZ、J23和W44葡萄糖发酵管为阳性，其余菌株呈阴性反应；菌株25025、J41和W69甘露醇反应呈阳性，其余菌株为阴性反应。

表2 牛支原体生化反应试验

2.5 样本及分离菌株的PCR检测结果

对2018年采自牛场样本163份牛鼻拭子和肺进行PCR检测，同时进行细菌学分离培养。结果共检测出阳性样本60份，且与细菌学检验结果一致如图4所示。同时将PCR扩增片段经胶回收，送上海生工宝生物工程有限公司测序，并将测序结果在NCBI中进行病原菌的鉴定和同源性的比对。结果表明，扩增片段为牛支原体的特异性条带，同源性的比对结果为93.02%～100%。

2.6 药物敏感性试验结果

通过将药敏试纸置于均匀涂布有菌液的固体培养基上，经5% CO2、37 ℃恒温培养1～2 d，观察并记录抑菌圈直径的大小，结果如表3所示。

注：M为Marker DL2000；1为阴性对照；2为标准阳性；3～21为被检出的阳性样本。

表3 药物抑菌圈直径大小的记录 mm

3 结论与讨论

牛支原体病在国外是一个常见病，但是在我国一直没有引起足够重视。国内牛群发病基本上按照牛胸膜肺炎疫情进行防治，误判病情而忽略了基本的防护常识，按照牛胸膜肺炎进行药物治疗，无法有效地保护发病牛群，不仅仅造成药物浪费，同时造成发病牛死亡,带来巨大经济损失。据报道[4]，临床健康犊牛购入24 h后，鼻腔中可检出牛支原体，但大部分牛7 d后经鼻腔可检牛支原体。金云云等[5]研究认为，多数牛在运达目的地后2周左右发病，不良环境下如途中遭雨淋等，牛可在运达目的地后第2天即发病。感染牛支原体的牛可携带病原体数月甚至数年而成为一个传染源，主要传播途径是通过飞沫呼吸道传播，近距离接触、吮吸乳汁或生殖道接触等也可传播牛支原体。

随着扶贫工作的深入开展，养牛产业成为了贵州省多地脱贫攻坚的主导产业及重要抓手。肉牛引进量不断增大，带来了一系列流行病发生和感染问题，肉牛支原体病就是主要疾病。因而笔者对牛支原体病在贵州省的发生、流行情况进行了调查，并对牛支原体病原进行了分离鉴定、生物学特性、分子诊断和药物敏感性等方面的研究工作。研究表明：牛支原体在分类上属于支原体属，该病原具有体型微小、基因组成分微量等显著特点[6]。支原体的培养基除基础营养物质外，尚需要丰富的血清蛋白、胆固醇和酵母浸液，血清主要提供胆固醇、脂肪酸和蛋白质，酵母浸液提供核苷前体、维生素及刺激生长的某些成分，牛支原体在pH 7.0～8.0范围内生长良好，在一定的CO2(5%～10%)环境、湿度(60%～80%)、温度(36～37 ℃)条件下生长较好，培养2～3 d，在低倍镜下观察琼脂培养基上长出“煎蛋样”菌落。牛患支原体肺炎后，往往并发或继发其他病原菌感染，而使病牛病情加重，因此不仅仅肺部发生病理变化，其他器官也随着病情的变化发生病变，甚至造成死亡。牛支原体既不分解葡萄糖、甘露醇、尿素酶、明胶，也不水解精氨酸，酚红葡萄糖肉汤呈阳性反应，接种菌株后，放置37 ℃厌氧培养24 h，培养基由红色变为黄色，七叶苷生化反应为阳性，符合牛支原体的生化特征。分离菌株的PCR检测及测序结果表明：扩增片段为牛支原体的特异性条带，在NCBI同源性的比对结果为93.02%～100%，这说明牛支原体是牛场重要的病原菌之一。由于引起呼吸道疾病的病因复杂，有必要进一步对其他病原菌(如病毒、细菌等)进行调查，以便更加全面地了解牛场的混合感染情况。抗生素治疗是控制和治疗牛支原体病的主要手段。由于支原体结构和功能的特点使其对β-内酰胺类抗菌药和磺胺类药物具有内在的抗性，但是对影响蛋白质或核酸合成的抗生素敏感[7]。近年来，牛支原体耐药的报道逐渐增多，从比利时、德国和意大利3个国家分离的牛支原体对替米考星、泰乐菌素等常用药具有严重的耐药性[8]。张利等[9]研究表明，牛支原体对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等药物的抵抗性增强。马艳君等[10]研究表明，牛支原体对恩诺沙星和头孢噻呋有耐药。本试验对分离的支原体进行了药物敏感性试验，结果表明对氟苯尼考、诺氟沙星、新霉素、头孢派酮、氧氟沙星高度敏感；对卡拉霉素、呋喃妥英、呋喃唑酮、连霉素中度敏感；对头孢曲松、强力霉素、头孢噻肟、四环素、甲氧嘧啶低度敏感；对利福平、头孢西丁、氨苄西林、青霉素G、林可霉素、头孢呋辛、阿莫西林、头孢唑林不敏感。这一结果对牛场支原体疾病的发生、流行及防治起到了积极的指导作用。