健脾益气合剂质量标准提升研究*

陈 朝，陈小媛，黄 敏，黄晓燕，韦家欢，杨正腾

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

健脾益气合剂是我院研发的传统中药制剂（桂药制字Z01060070），由黄芪、党参、陈皮、何首乌、白术、麦冬等中药组方，可有效改善反复呼吸道感染患儿的临床症状、体征及免疫状态，在防治小儿反复呼吸道感染及治疗脾虚型厌食症方面已取得满意疗效［1-3］。健脾益气合剂现行质量标准仅有相对密度及合剂项下规定的检查项，无专属性鉴别项与含量测定项，对该制剂的质量控制较弱。本研究中增加了黄芪、何首乌、白术、陈皮的薄层色谱（TLC）法，以陈皮有效成分橙皮苷作为含量测定指标，建立了专属性较强的高效液相色谱（HPLC）法，可为完善和提高该制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪；美国Waters 2998 型检测器（美国Waters 公司）；YOKO-CS 型紫外线透射反射成像仪（武汉药科新技术开发有限公司）；GH-25型电子分析天平（日本A&D 公司，精度为万分之一）；CD-UPT 型超纯水机（成都越纯科技有限公司）；毛细管（国药控股有限公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂，规格为10 cm×10 cm）。

1.2 试药

健脾益气合剂（广西中医药大学第一附属医院制剂室，批号为20170819，20180122，20180515）；黄芪甲苷对照品（批号为110781-200613），橙皮苷对照品（批号为110721-201316），大黄素对照品（批号为110756-201512），制何首乌对照药材（批号为121454-201405），白术对照药材（批号为120925-200708），陈皮对照药材（批号为120969-201510），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

黄芪［4］：取本品20 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3 次，每次20 mL，弃去碱液，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗至中性，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。按处方工艺取缺黄芪药材的阴性样品20 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液5 μL、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水（20 ∶10 ∶11 ∶5，V/ V/ V/ V）10 ℃以下放置30 min 的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365 nm）灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果见图1 A（温度为26 ℃，相对湿度为65%，展距为7.0 cm）。

图1 薄层色谱图

制何首乌［5］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。按处方工艺取缺制何首乌药材阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取制何首乌对照药材0.5 g，加甲醇30 mL，超声提取30 min，滤过，蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，同法制备对照药材溶液。取大黄素对照品0.5 g，加甲醇1 mL，作为对照品溶液。分别吸取大黄素对照品溶液2 μL、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL、制何首乌对照药材溶液4 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（14 ∶2 ∶1，V/V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与对照品及对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点。结果见图1 B（温度为25 ℃，相对湿度为60%，展距为7.0 cm）。

白术［6］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取2 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，30 mL 水洗涤，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。按处方工艺取缺白术药材阴性样品20 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取白术对照药材2 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，同法制备对照药材溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502 中TLC 法试验，分别吸取供试品溶液、阴性对照品溶液各2 μL、对照药材溶液1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸（10 ∶1 ∶0.1，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%氢氧化钠溶液，于365 nm 波长下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果见图1 C（温度为27 ℃，相对湿度为55%，展距为7.5 cm）。

陈皮［7-8］：取本品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。按处方工艺取缺陈皮药材的阳性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取陈皮对照药材1 g，加水60 mL，煮沸30 min，滤过，滤液浓缩成20 mL，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取橙皮苷对照品1.7 mg，加甲醇1 mL，振荡30 s，4 ℃静置过夜，取上清液，即得橙皮苷对照品饱和溶液，作为对照品溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502 中TLC 法试验，分别吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶17 ∶13，V/ V/ V）为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液，置紫外光（365 nm）灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液、对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果见图1 D（温度为26 ℃，相对湿度为60%，展距为8.0 cm）。

2.2 橙皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：WondaCract ODS-2 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：285 nm。

2.2.2 溶液制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得对照品溶液。精密量取本品1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤（0.45 μm），即得供试品溶液。按处方工艺取除陈皮外的其他药味，依法制备阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取橙皮苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，分别进样测定，记录色谱图（见图2）。结果橙皮苷的保留时间约为21.45 min，陈皮阴性对照品溶液的色谱图中在橙皮苷的位置无吸收峰，表明方法专属性强。

线性关系考察：取橙皮苷对照品3.8 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为7.6，15.2，30.4，60.8，91.2，121.6 μg/mL 的对照品溶液。分别吸取10 μL，按拟订色谱条件进样测定峰面积，每个样品测定2 次，取平均值。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1.561 8×104X-1.486 3×104，r=1.000 0（n=6）。结果表明，橙皮苷质量浓度在7.6 ～121.6 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取橙皮苷对照品溶液，按拟订色谱条件重复进样6 次，测定峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.45%（n=6），表明仪器精密度良好。

图2 高效液相色谱图

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为20180515），室温放置，分别于0，1，5，12，24，48 h 时进样测定。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.86%（n=6），表明供试品溶液在48 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20180515）样品，依法制备供试品溶液共6 份，每份进样测定2 次。结果橙皮苷含量的RSD为0.65%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取样品（批号为20180515）1 mL，共8 份，分别精密加入0.47 mg/mL 的橙皮苷对照品溶液各1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 橙皮苷加样回收试验结果（n=8）

2.2.4 样品含量测定

取 3 批（ 批 号 分 别 为 20170819，20180122，20180515）样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定橙皮苷含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/mL，n=3）

3 讨论

多组分、多指标的质量控制体系的意义：民族药制剂现阶段整体质量标准水平较低，仍多集中于药材基源及鉴定的研究，并未充分利用现代分离分析技术和方法对其物质基础进行深入探讨，多数尚未建立多组分、多指标的质量控制体系，严重制约了民族医药的发展［9］。2016年，健脾益气合剂被确认为《广西医疗机构中药民族药制剂标准（第一卷）》拟收载质量标准提高的品种。本研究中对该制剂进行深入研究，提高并拟订了新的质量标准。

指标成分选择：陈皮理气健脾，为健脾益气合剂的主药，而橙皮苷是陈皮的主要活性成分，故选择橙皮苷作为含量测定指标成分。橙皮苷为醇溶性成分［10］，且在甲醇中的溶解性优于乙醇［11］。健脾益气合剂为液体制剂，故供试品溶液制备方法采用甲醇直接稀释法，待测峰无杂质干扰，分离度好，加样回收率高。

展开剂选择：2015年版《中国药典（一部）》中陈皮［6］的薄层层析法采用二次展开方法且含用甲苯，操作较复杂。因此，考察了三氯甲烷-甲醇-水（65 ∶35 ∶10，V/V/ V）［7］和三氯甲烷-丙酮-甲醇-冰醋酸（5 ∶1 ∶1 ∶0.02，V/ V/ V/ V）［8］2 种展开系统，发现斑点均不够清晰。以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶7 ∶13，V/ V/ V）为展开剂后，最终斑点清晰，操作简单，且避免了甲苯和氯仿有害试剂的使用。

流动相选择：多采用乙腈（甲醇）-磷酸（醋酸）-水系统。本研究中经对比考察，最终筛选出分离效果好、基线平稳、保留时间适中的乙腈-水（含0.1%磷酸溶液）系统作为流动相。曾考察不同仪器（岛津LC -20A、Waters 2695）、不同色谱柱（Wonda Sil C18Super，WondaCract ODS-2）、不同柱温（25，30，35 ℃）和不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）对橙皮苷含量测定的影响，结果各色谱条件下的RSD均小于3.00%，分离效果理想，表明方法耐用性好。

吸收波长选择：取橙皮苷对照品溶液适量，在波长210 ～400 nm 范围内扫描，结果显示，橙皮苷于285 nm波长处有最大吸收，因此选择285 nm 作为检测波长。

综上所述，在健脾益气合剂现行质量标准基础上，增加了黄芪、制何首乌、白术、陈皮的TLC 鉴别及有效成分指标橙皮苷的含量测定，方法简单易行，高效快速，质量可控，为完善和提升其质量标准提供了依据。