“培土生金法”对早期支气管哮喘幼鼠气道炎症影响分析

刘克伟 陈英妹 甄如义

广州市花都区妇幼保健院 （胡忠医院）儿科，广东广州 510800

支气管哮喘是一种常见的儿童疾病，近年来可能由于城市化水平的推动，空气污染水平上升，导致该疾病发病率有一定上升趋势[1]。该疾病的鉴别诊断有一定难度，且婴幼儿哮喘反复发作患儿使用糖皮质激素、白三稀受体拮抗剂治疗方法存在争议，寻找一种切实可行的方法治疗婴幼儿哮喘一直是儿科中的热点问题[2]。本研究通过幼鼠模型，探讨“培土生金法”对其气道炎症改善情况，旨在探讨儿童哮喘的药理机制，现报道如下。

表1 Underwood组织病理学评分标准

1 资料与方法

1.1 研究对象及所需药物

1.1.1 研究对象 由广州中医药大学生物学研究所动物中心提供30只无特定病原体10d雌性幼鼠纳入研究。

1.1.2 所需药物 （1）Amresco品牌鸡卵清蛋白，CAS编号：9006-59-1；（2）Elabscience品牌小鼠IL-10、IL-17及TGF-β1酶联免疫吸附测定试验盒；（3）异功散：人参、白术、茯苓、广陈皮、甘草各取一份配成水煎剂，制成生药质量浓度1g/mL的溶剂；（4）常乐康胶囊：山东科兴生物制药有限公司，S20020015，420mg×12 粒。

1.2 方法

幼鼠首先进行环境适应性喂养3d，后分为正常对照组、模型组、常乐康组、异功散低量组、异功散中量组及异功散大量组六组，每组5只幼鼠。所有幼鼠于1、13d进行腹腔注射，正常对照组幼鼠注射生理盐水0.2mL，其余五组幼鼠均注射10%卵清蛋白（OVA）溶液0.1mL、等体积佐剂液态铝混合进行致敏。随后于20～22d将进行致敏的幼鼠放置于密闭容器雾化吸入20min质量分数3%的OVA溶液，正常对照组幼鼠吸入生理盐水，1次/d，幼鼠出现烦躁、喷嚏、抓鼻、前肢缩抬、呼吸短促、腹部凹陷等情况视为哮喘造模完成。

同时于造模开始时间起，1次/d从口腔灌注药物直至造模结束，参照《实验药理方法学》换算药物剂量，大量组给予20g/kg剂量的异功散、中量组给予10g/kg的异功散、低量组给予5g/kg的异功散。常乐康组使用420mg/次常乐康菌粉稀释为25mL/kg溶液从口腔灌服。模型组、正常对照组幼鼠灌服同等剂量生理盐水。

所有幼鼠在末次激发后24h麻醉致死，剖开胸腔分离肺组织用注射器沿气管插管，生理盐水清洁左肺、支气管肺泡灌洗液（BALF）3000r/min离心5min取上清液，-80℃保存。肺组织病理观察：取右肺组织脱水包埋，切片进行HE染色，显微镜下观察肺组织病理学变化。IL-10、IL-17及TGF-β1：采用Elisa方法进行测定。

1.3 评分标准

用Underwood的标准对肺组织病理学改变进行评分[3]，具体评分标准见表1。

1.4 统计学方法

采用SPSS21.0统计学软件对本研究数据进行分析，计量资料以（）表示，采用t检验，多组间均数比较采用F检验，多组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化

正常对照组肺组织仅见少量炎症细胞浸润、无明显组织损伤、无水肿、上皮细胞完整；模型组可见重度炎症细胞浸润、脓肿形成、组织坏死、上皮细胞黏液增多；常乐康组存在中度炎症细胞浸润、组织有一定损伤、轻微水肿；大量异功散组炎症细胞浸润程度低、少量上皮细胞脱落；中量异功散组炎症细胞浸润程度中等、上皮细胞有一定脱落、存在水肿；低量异功散组炎症组织浸润程度较重、存在水肿、上皮细胞脱落较多。见图1。

Underwood肺组织病理学评分显示模型组评分显著高于正常对照组、常乐康组、异功散大量组、异功散中量组、异功散低量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2 IL-10、IL-17及TGF-β1指标比较

模型组支气管肺泡灌洗液中IL-10含量较低，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；TGF-β1、IL-17含量与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；常乐康组、异功散组IL-10含量均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；异功散低剂量组IL-10与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；异功散低剂量IL-17与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 各组肺组织病理变化情况

表2 肺组织HE染色underwood评分比较（x ± s，分）

3 讨论

在中医中，认为哮喘主要是由于伏痰留饮导致的，同机体脾脏间具有显著关系，机体肺、脾具有相互依赖、调节气血津液、水液代谢的作用[4]。肺主气，脾益气；肺主行水，脾主运化水湿。故肺与脾的病理关系主要表现在气和水液代谢功能异常方面，脾肺相关的哮喘理论在中医肺系系统疾病中具有重要的理论支撑作用[5]。

表3 支气管肺泡灌洗液IL-10、IL-17及TGF-β1指标比较（x ± s，pg/mL）

儿童在中医理论中认为脏器较为娇嫩，行气未充，通常来讲，儿童的支气管哮喘都不是由单纯的肾虚引发，多和脾虚、肺常不足具有联系[6]。“培土生金法”即补脾（土）益气而达到补益肺（金）气的方法，适用于脾胃虚弱，不能滋养肺而致肺虚脾弱之证[7]。异功散方剂出自《小儿药证直诀》，又称为五味异功散、钱氏异功散，其记载“主治脾虚气滞、饮食减少、胸脘痞闷、食入作胀、大便溏薄、神疲气短、身体羸瘦、或面部浮肿者。”该方剂脱胎于四君子汤，在其基础上加用了陈皮，旨在取得行气化滞，醒脾助运之功用，在小儿“脾常不足”上正好对症，该方剂在我国已被广泛加以应用[8]。对于支气管哮喘的发病机制，Th1及Th2平衡失调理论已经难以站住脚跟，在相关研究[9]中表明CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞（Treg）同Th17之间存在密切联系。Treg细胞作为机体免疫反应程序中的关键性调节因素，其能够诱导机体产生免疫性耐受，IL-10及TGF-β因子都可以起到T细胞增殖的抑制作用，同时也能对Th1/Th2细胞因子反应进行抑制[10]。Th17细胞可以分泌IL-17，进而对人体上皮细胞产生刺激，随后分泌出趋化因子更加重中性粒细胞的浸润作用，最终导致气道炎症[11]。可见Th17及Treg是过敏性疾病（包括哮喘）的重要诱导因素，同时，在机体早期，Treg/Th17能够直接受到微生物的影响，极易对机体（幼鼠或人体）肠道菌群/黏膜免疫的正常构建产生影响[12]。在彭吉祥等[13]的研究中指出，双歧杆菌可以平衡Treg/Th17细胞亚群数量，促进Treg型细胞因子表达，从而抑制Th17型细胞因子分泌[14-15]。在本研究中，异功散对早期支气管哮喘幼鼠进行干预能够改善其炎症反应，幼鼠的炎症反应改善程度与异功散剂量有直接关联，揭示异功散在支气管哮喘的治疗和预防中具有正面作用，能够提高IL-10含量，但IL-17含量并未发现显著关联性。

综上所述，异功散对于支气管哮喘具有一定的防治作用，但其对Treg/Th17的平衡作用仍待进一步的考证。