丹酚酸B对金黄色葡萄球菌肺炎幼年小鼠肺组织修复及脑神经保护作用的观察

李建成，冯 斌

1)驻马店市中心医院重症医学科 河南驻马店 463000 2)河南中医药大学第一附属医院儿科 郑州 450003

肺炎是儿童常见的呼吸系统疾病之一，且以金黄色葡萄球菌等细菌性及病毒性肺炎较为多见[1]，同时，由于儿童免疫系统发育尚未成熟，如果肺炎治疗不及时，疾病可能进展为细菌性脑膜炎等，造成肺组织及脑神经损伤，甚至造成患儿死亡[2]。丹酚酸B是从传统中药材丹参中提取得到的活性成分，近年来研究[3-4]表明，丹酚酸B具有抗炎、神经保护等多种药理作用。本文通过研究丹酚酸B对金黄色葡萄球菌肺炎幼年小鼠(幼鼠)肺组织修复及脑神经保护的作用及机制，为丹酚酸B在肺炎患儿中的临床应用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器丹酚酸B购自上海源叶生物科技有限公司；SOD活性检测试剂盒及MDA检测试剂盒,TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA检测试剂盒，离子钙接头分子(Iba-1)、p-NF-κBp65、NF-κBp65及GAPDH抗体，免疫荧光染色试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌菌株(编号ATCC4300)购自美国ATCC；ECLIPSETS100-F 倒置显微镜购自日本 Nikon 公司；MRZ14M010高速冷冻离心机购自美国Beckman公司；SpectraMax190多功能酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司；ChemiDoc XRS凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；BX50/BX-FLA/DP70型光学/荧光显微镜购自日本Olympus公司；UniCel DxC 800 Synchron全自动生化分析仪购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。

1.2动物分组及处理健康雄性C57BL/6幼鼠125只，购自河南省实验动物中心，4～6周龄，动物房温度(22±2) ℃，湿度(50±10)%，适应性喂养1周，除25只幼鼠作为对照组外，其余100只幼鼠参照文献[5]方法建立金黄色葡萄球菌肺炎幼鼠模型。7.5 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射对幼鼠进行麻醉后，使用移液枪取金黄色葡萄球菌菌液10 μL(1×1010CFU/mL)缓慢滴入幼鼠鼻腔，使幼鼠与操作台成45°角保持1 min，1次/d，连续3 d，以幼鼠出现呼吸急促、活动量减少及肺组织病理改变视为造模成功。100只均造模成功。将造模成功的幼鼠分为4组，每组25只，分别为模型组、丹酚酸B低剂量组、丹酚酸B中剂量组、丹酚酸B高剂量组。丹酚酸B低、中、高剂量组分别按照5、10、20 mg/kg腹腔注射丹酚酸B[6-7]，对照组及模型组腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，连续7 d[5-6]。

1.3各组幼鼠动脉氧分压(PaO2)、氧合指数(OI)的测定各组幼鼠最后一次给药24 h后，每组取10只幼鼠，7.5 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，自左心室采血2 mL，采用血气分析仪检测PaO2、OI。

1.4各组幼鼠肺组织湿干重比值(W/D)的测定每组取10只幼鼠，颈椎脱臼法处死幼鼠后迅速分离幼鼠肺组织，并用滤纸吸干水分后置于玻璃试管中称重，然后置于烘箱中，80 ℃烘烤24 h至恒重后，计算各组幼鼠肺组织W/D。W/D=幼鼠肺组织湿重(mg)/幼鼠肺组织干重(mg)。

1.5各组幼鼠学习记忆能力的测定利用Morris水迷宫，对各组幼鼠进行定位巡航实验和空间探索实验。每组取15只幼鼠，将幼鼠放入水槽自由游泳2 min，适应迷宫内、外环境及游泳状态，持续训练3 d，2次/d。于第4天进行定位巡航实验，幼鼠从4个不同的标记点分别入水，记录其自入水到爬上平台所需要的时间，记为逃避潜伏期；如果幼鼠在90 s内未找到平台，则将其引导至平台休息10 s，逃避潜伏期记为90 s。定位巡航实验结束后进行空间探索实验：撤出平台，将幼鼠放入水中自由游泳，记录首次穿过平台所在象限需要的时间以及在90 s内穿过平台的次数。采用Morris水迷宫图像自动监视处理系统测定逃避潜伏期、首次穿过平台时间、90 s内穿过平台次数。

1.6各组幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的测定水迷宫实验结束后，每组取15只幼鼠摘除眼球取血至干净离心管中，于4 ℃静置4 h，然后置于离心机中4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测幼鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.7各组幼鼠肺组织SOD活性及MDA水平的测定每组取15只幼鼠，取肺组织，用4 ℃预冷的生理盐水洗去表面血液后，用滤纸吸干表面水分，按照试剂盒说明书检测幼鼠肺组织SOD活性及MDA水平。

1.8各组幼鼠肺组织病理学检查每组取15只幼鼠，处死后取肺组织，在体积分数10%中性甲醛中固定后脱水、石蜡包埋，5 μm厚切片，常规HE染色，显微镜下进行病理学观察。

1.9各组幼鼠肺组织中NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的检测每组取15只幼鼠，取肺组织裂解后提取总蛋白，蛋白定量后，取等量蛋白进行电泳分离、转膜，经NF-κBp65、p-NF-κBp65及内参GAPDH抗体(均1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000稀释)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，应用Image J图像分析系统测定条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.10各组幼鼠脑组织中Iba-1蛋白的免疫荧光染色每组取15只幼鼠脑组织制作石蜡切片，体积分数5%胎牛血清封闭后，滴加Iba-1一抗 (1∶200稀释)，4 ℃过夜，依次经山羊抗兔二抗(1∶500稀释)室温下孵育50 min，CY3孵育10 min，经含吐温磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加抗荧光淬火封片液，孵育5 min，DAPI染色10 min后使用荧光显微镜观察，利用Image Pro Plus 6.0合成Merge图，Image J图像分析系统分析平均荧光强度，即蛋白的表达水平。平均荧光强度=区域荧光强度总和/区域面积。

1.11统计学处理应用SPSS 19.0对数据进行分析。5组幼鼠W/D、PaO2、OI，逃避潜伏期、首次穿过平台时间、90 s内穿过平台次数，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺组织SOD活性、MDA水平，肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表达水平及p-NF-κBp65/NF-κBp65比值，脑组织Iba-1蛋白表达水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.15组幼鼠肺组织W/D、PaO2、OI的比较结果见表1。由表1可知，与对照组相比，模型组幼鼠肺组织W/D升高，PaO2、OI降低；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠肺组织W/D降低，PaO2、OI升高，随剂量升高，各指标改善更为显著。

表1 5组幼鼠肺组织W/D、PaO2、OI的比较

2.25组幼鼠学习记忆能力的比较结果见表2。由表2可知，与对照组相比，模型组幼鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间延长，90 s内穿过平台次数减少；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间缩短，90 s内穿过平台次数增加，随剂量升高，各指标改善更为显著。

表2 5组幼鼠逃避潜伏期、首次穿过平台时间、90 s内穿过平台次数的比较

2.35组幼鼠血清炎症因子水平的比较结果见表3。由表3可知，与对照组相比，模型组幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低，随剂量升高，3种炎症因子水平降低更为显著。

表3 5组幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的比较 ng/L

2.45组幼鼠肺组织SOD活性及MDA水平的比较结果见表4。由表4可知，与对照组相比，模型组幼鼠肺组织SOD活性降低，MDA水平升高；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠肺组织SOD活性升高，MDA水平降低，随剂量升高，各指标改善更为显著。

表4 5组幼鼠肺组织SOD活性及MDA水平的比较

2.55组幼鼠肺组织病理学观察结果见图1。与对照组相比，模型组幼鼠肺泡边缘不整齐，间质水肿，可见大量炎性细胞浸润，支气管上皮细胞坏死，腔内有大量的炎性细胞，血管周围水肿，提示造模成功；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠肺泡边缘结构明显改善，丹酚酸B低、中剂量组幼鼠肺间质水肿及支气管上皮细胞坏死明显减轻，少见炎性细胞浸润，丹酚酸B高剂量组幼鼠肺组织病理学明显改善，偶见炎性细胞浸润，少见支气管上皮细胞坏死。

A:对照组；B:模型组；C:丹酚酸B低剂量组；D:丹酚酸B中剂量组；E:丹酚酸B高剂量组

2.65组幼鼠肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65及脑组织Iba-1水平的比较结果见图2、3及表5。可知，与对照组相比，模型组幼鼠肺组织NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、脑组织Iba-1水平升高；与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠肺组织NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、脑组织Iba-1水平降低，随剂量升高，各指标改善更为显著。

1:对照组；2:模型组；3:丹酚酸B低剂量组；4:丹酚酸B中剂量组；5:丹酚酸B高剂量组

图3 5组幼鼠脑组织Iba-1的免疫荧光染色(×200)

表5 5组幼鼠肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65及脑组织Iba-1水平的比较

3 讨论

肺炎以细菌性和病毒性肺炎较为多见，而细菌性肺炎的常见致病菌主要有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌等[1-2]。由于儿童自身免疫系统发育尚未完全，所以肺炎患者中以儿童较为多见，同时表现出治疗周期长的特点，若治疗不及时，容易引发血行感染，进而导致细菌性脑膜炎的发生，严重者可导致患儿不可逆性智力下降，甚至死亡[2]。

丹酚酸B是从唇形科植物丹参的根及茎中提取得到的单体化合物，研究[3]表明丹酚酸B具有抗炎、心肌保护、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用。近年来丹酚酸B对肺组织的保护作用及损伤修复作用也逐渐被发现。金粟等[8]发现丹酚酸B具有抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化病理进展的作用；同时，张敏等[9]发现丹酚酸B能够通过抑制肺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路抑制肺纤维化进展；梁家红等[10]研究发现丹酚酸B具有明显的抗炎及抗凋亡作用，从而发挥对急性肺损伤小鼠的保护作用。同时，研究[11]表明，丹酚酸B也有显著的神经保护作用，其作用机制可能与抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化有关。研究[12]表明大鼠肺损伤后，TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高加重肺组织损伤，同时肺组织MDA水平的升高及SOD活性下降则加重了肺组织氧化损伤，所以在肺损伤后上述指标的改善直接关系到肺损伤的预后及转归。

本研究结果表明，与模型组相比，丹酚酸B低、中、高剂量组幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺组织W/D、MDA水平降低；PaO2、OI、肺组织SOD活性升高，肺组织病理学损伤明显改善；提示丹酚酸B能够降低金黄色葡萄球菌肺炎幼鼠体内炎症因子水平和肺组织氧化应激水平，改善肺炎幼鼠肺组织病理学变化。NF-κB信号通路是机体内重要的信号转导通路，与免疫、炎症、应激反应等多种生物过程密切相关，研究[13]表明，NF-κB信号通路的过度激活可以诱导并加重体内炎症反应。NF-κBp65为NF-κB蛋白家族的成员之一，在机体炎症反应的发生及进展过程中起到关键作用。本研究表明，丹酚酸B各剂量组幼鼠肺组织NF-κBp65、p-NF-κBp65水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，提示丹酚酸B能够降低肺炎幼鼠NF-κB信号通路及相关蛋白水平，抑制NF-κBp65的磷酸化，进而发挥其抗炎及肺组织保护作用。

小胶质细胞广泛分布在中枢神经系统，正常状态下的小胶质细胞处于休眠或静息状态，当脑组织发生炎症反应时，会激活小胶质细胞发生形态及功能变化，激活免疫应答，释放大量炎症介质及细胞毒素[14]，而Iba-1的高表达是脑组织小胶质细胞激活的标志。本实验结果表明，与模型组比较，丹酚酸B各剂量组幼鼠逃避潜伏期及首次穿过平台时间缩短，90 s内穿过平台次数增加，提示丹酚酸B能明显改善幼鼠的学习记忆能力；丹酚酸B各剂量组幼鼠脑组织Iba-1水平降低，提示丹酚酸B能够显著改善肺炎幼鼠脑组织小胶质细胞的激活，抑制脑组织炎症反应，进而起到神经保护作用。

综上所述，丹酚酸B能够减轻金黄色葡萄球菌肺炎幼鼠体内炎症状态，改善幼鼠肺组织及脑组织炎症水平，保护幼鼠脑神经，提高幼鼠学习记忆能力。