氢化物发生-原子荧光光谱法测定饲料用香菇菌糠中硒含量的方法研究

姚清国 祁永浩

（石家庄学院化工学院，河北石家庄050035）

香菇菌糠是香菇栽培过程中，菌棒在子实体采摘后剩下的培养基废料，含有丰富的粗纤维和粗蛋白等营养成分[1]。近年来我国香菇产业发展迅速，每年产生近千万吨的香菇菌糠，大部分作为农业废弃物进行简单的处理，包括就地焚烧、制作沼气、制成有机肥等，这些处理方式存在附加值低、利用率低等缺点[2]。香菇菌糠在栽培过程中在菌丝胞外酶的作用下，所含纤维素和半纤维素被不同程度的降解成小分子糖类，粗蛋白和粗脂肪的含量显著提高，并含有丰富的氨基酸和微量元素，菌糠经过去膜、晾干、粉碎处理后加工成动物饲料，可以为养殖业提供大量廉价的饲料原料，是一种很有前景的高效利用方式[3]。

硒元素是人体必需的微量元素，在体内可合成硒代半胱氨酸，发挥着抗氧化、提高免疫力、预防疾病等重要的生理功能[4]。研究表明克山病和大骨节病与人体硒元素缺乏密切相关[5]。硒也是饲料中重要的微量元素之一，饲料中添加适量的硒有助于动物的生长繁育、提高免疫力、抗氧化、预防疾病[6-8]。同时硒也是一种安全范围较窄的必需元素，日粮中需要的硒含量和有潜在毒性的硒含量之间只相差10～20倍，硒过量摄入也存在着硒中毒的风险[9]。因此，测定香菇菌糠中的硒含量对于其进一步加工成动物饲料具有重要意义。

到目前为止，硒的测定方法有很多，包括紫外可见分光光度法[10]、原子荧光光谱法[11]、原子吸收光谱法[12]、电感耦合等离子体原子发射光谱法等[13]，其中氢化物发生-原子荧光光谱法测定硒具有灵敏度高、精密度好、线性范围宽等优点[14-15]。因此，本文采用氢化物发生-原子荧光光谱法测定了香菇菌糠中硒的含量，对样品的前处理的方法和上机测试的条件进行了优化，并对河北省三个食用菌产区的香菇菌糠进行了硒含量的测定，为香菇菌糠在饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇菌糠取自河北省平泉、阜平、平山的食用菌基地，去掉外菌袋，烘干粉碎后加工成饲料用菌糠，通过四分法取样，彻底烘干装入塑料自封袋中备用。实验所用浓盐酸、高氯酸、浓硝酸、硼氢化钾、氢氧化钠等试剂均为国产优级纯；硒标准溶液购自中国计量科学研究院；实验用水本实验室自制的超纯水(18.25 MΩ·cm)。

1.2 所用仪器

检测采用氢化物发生-原子荧光光谱仪(型号AFS-6500，北京海光仪器有限公司)，样品消解采用电热板(型号EG20B，北京莱伯泰科仪器股份有限公司),分析天平(型号JJ124BC，常熟双杰仪器厂)，电热恒温干燥箱（XMTD-8222，上海精宏公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 采用湿法消化预处理样品

将香菇菌糠去掉菌袋，粉碎烘干，用分析天平精确称取各样品0.200 0～0.500 0 g于100 ml小烧杯中，同时做不加样品的空白对照，每个烧杯中加入10 ml混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)，盖上平皿后置于通风橱中室温静止过夜。第二天取下平皿，放上曲颈小漏斗，在通风橱中置于电热板上加热，设定的温度和时间见表1，步骤4 中当溶液变成澄清无色并瓶中出现卷曲状白烟时，停止加热冷却到室温，向烧杯中加入2 ml 超纯水，继续加热至剩余体积1～2 ml，冷却至室温再加入5 ml 浓盐酸，在室温还原3 h以上。最后将小烧杯中溶液转移至50 ml 容量瓶内，用超纯水将曲颈漏斗和烧杯仔细冲洗3遍，冲洗液也转移至容量瓶中，再用超纯水定容至刻度线备用。

表1 电热板消解温度设定程序

1.3.2 样品上机检测和结果计算

检测前先开机通入氩气，设定好各项参数后预热30 min，用5%盐酸做载流，8%的硼氢化钾碱溶液（NaOH 浓度为5 g/l）做还原剂，将待测样品装入进样管后按顺序放在自动进样器上，先测量标准溶液，再测样品空白，后测每个样品。

浓度计算公式：X=(C-C0)×V/m

式中：X——样品中硒的含量（μg/kg或μg/l）；

C——样品消化液测定的浓度（μg/l）；

C0——样品空白消化液测定浓度（μg/l）；

m——样品称量质量（体积）（g或ml）；

V——样品预处理后定容的总体积（ml）。

2 结果与分析

2.1 测定条件的优化选择

使用正交试验设计选择仪器条件，分别定义A为光电倍增管的负高压，包含250、260、270 V 三个水平；定义B为灯电流，包含60、70、80 mA三个水平，定义C 为载气流量，包含300、400、500 ml/min 三个水平，定义D 为屏蔽气流量，包含700、800、900 ml/min三个水平，建立4 因素3 水平的L9(34)正交试验设计表，使用5 μg/l硒标准溶液，根据试验设计进行9组试验，结果见表2。

通过表2可知，影响测定结果中荧光强度的因素由大到小的排列顺序依次为负高压＞灯电流＞载气流量＞屏蔽气流量。根据实验结果，绘制出荧光强度随着负高压变化的曲线，如图1所示。

由图1可知，荧光信号强度随着光电倍增管的负高压的升高而增强，在三个水平上270 V时荧光信号强度最高，所以选择负高压为270 V为后续的测定条件。根据表2的实验结果, 绘制出测定结果中荧光信号强度随灯电流（mA）的变化曲线如图2所示。

表2 L9(34)正交试验方案及测定结果和基本计算

图1 负高压对硒荧光强度的影响

图2 灯电流对荧光强度的影响

由图2可以推出，荧光信号强度随着灯电流的升高而增强，在三个水平上80 mA 时荧光信号强度最高，最终选定80 mA为后续测定的条件。

通过表2可知，载气和屏蔽气对荧光强度影响不大，在实际操作中载气流量过低会使信号不稳，载气流量过高的会带走硒的氢化物而使荧光信号减弱，综合考虑以上分析结果和仪器的测试的实际测试效果，最终确定载气的流量为：载气流量300 ml/min、屏蔽气流量800 ml/min。

结合前期的实验，最终选出仪器测试硒元素的最优条件：光电倍增管的负高压270 V、灯电流80 mA、原子化器高度8 mm、原子化器温度800 ℃、进样体积2 ml、载气流量300 ml/min、屏蔽气流量800 ml/min、读数方法为峰面积、读数时间16 s、延迟时间为4 s，在此优化的条件下，测定结果准确稳定。

2.2 检测所用试剂的优化

2.2.1 载流溶液中盐酸浓度的优化

载流中的盐酸和还原剂反应产生氢气，使仪器产生氢火焰，盐酸浓度过低会使与硼氢化钾的反应不完全，不能产生足够的氢气和氢化物，过高浓度的盐酸会对设备有腐蚀作用。采用5 μg/l 硒标准溶液进行测定，分别考察了2.5%～10%的盐酸作为载流对荧光强度的影响，结果如图3所示：

由图3可知，当盐酸浓度低于5%（v/v）时，荧光信号随盐酸浓度的增加而增加，当盐酸浓度大于5%（v/v）时，荧光信号强度高且基本保持稳定，因此选择5%（v/v）的盐酸作为测定的载流溶液。

图3 盐酸溶液浓度对荧光强度的影响

2.2.2 硼氢化钾浓度的选择

硼氢化钾作为四价硒的还原剂，将四价硒还原成硒化氢，硼氢化钾的浓度影响着硒的还原程度。采用5 μg/l 硒标准溶液进行测定，分别研究了2、4、6、8、10、12 g/l的KBH4作为还原剂对荧光强度的影响。

由图4 可知，在KBH4浓度小于8 g/l，荧光信号强度随着浓度的增大而增加，当KBH4浓度大于8 g/l时，信号强度有所下降，推测可能是高浓度的KBH4与盐酸反应产生过多氢气，带走部分还原的硒化氢而导致荧光信号降低，故实验测定选用8 g/l的硼氢化钾溶液作为还原剂使用。

图4 硼氢化钾浓度对荧光强度的影响

2.2.3 氢氧化钠浓度对荧光强度的影响

为了保证还原剂KBH4的稳定性, 需在配制KBH4溶液时加入NaOH 使溶液保持碱性, 但NaOH 的浓度应严格把控，浓度低时碱性弱，配置的KBH4容易分解，浓度高时会中和载流中盐酸, 从而降低反应体系的酸度而影响测定结果。为了研究氢氧化钠浓度对测定的影响，采用5 μg/l 硒标准溶液进行测定, 分别配置了2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/l氢氧化钠溶液进行测试，分别测定其荧光强度如图5所示。

图5 氢氧化钠浓度对荧光强度的影响

由图5 可知, 在氢氧化钠浓度小于5 g/l，荧光信号强度随着氢氧化钠浓度的增加而增加，当氢氧化钠浓度大于5 g/l 时，信号强度有所下降，故后续实验中将硼氢化钾溶解到5 g/l 氢氧化钠溶液中作为还原剂使用，为了防止硼氢化钾分解，硼氢化钾的碱溶液应当天使用当天配制，不隔夜存放，防止分解失效。

2.3 线性关系、检出限和精密度的研究

为了研究硒含量与荧光强度的线性关系，分别测定了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/l硒浓度的荧光强度，其结果如图6所示。

图6 标准曲线

由图6 可以看出，硒标准液含量在0～5 μg/l 范围内的线性关系良好，相关系数r=0.999 5，回归方程y=281.85x-9.545 5。在优化实验条件下，通过对空白样品11次测量，计算其测量结果的标准偏差的3倍除以标准曲线的斜率即为检测限，计算得为0.003 μg/l。对2.5 μg/l 硒标准溶液进行平行测定(n=6)，计算得精密度(RSD)为4.2%。

2.4 方法准确度研究

通过加标回收实验测定方法的准确度，选取菌糠样品按照1.3中实验方法，进行加标回收实验(n=6)，结果见表3所示。

表3 加标回收实验结果（n=6）

由表3 可知，在不同水平上进行加标回收，该检测方法的回收率在95.12%～98.30%之间。

2.5 饲料香菇菌糠中硒含量的检测

河北是我国北方的香菇生产大省，平泉市被称为“中国食用菌之乡”，每年生产的香菇菌糠超过100万吨，从平泉、阜平、平山的食用菌基地收集香菇栽培后的菌糠，去掉外膜，烘干后粉碎等处理，形成饲料用香菇菌糠，三种样品分别进行前处理后上机测定，每个样品做三个重复实验，其结果如表4所示。

由表4可知，三个产区的饲料用菌糠所含硒的量在2.54～2.77 μg/kg 之间。同一产地多次测定的结果之间差别不大，不同地区的香菇菌糠所含的硒有差别，其中阜平所产香菇菌糠所含硒比较高，其多次测定平均值为2.77 μg/kg，平泉所产香菇菌糠所含硒略低，其多次测定平均值为2.54 μg/kg。

表4 不同产地的香菇菌糠中硒含量的测定

3 结论

硒是动物体必需的微量元素，在体内有着重要的生理功能，硒在体内的含量影响着动物的生长发育、生殖性能、防病和抗病等方面[16]。本实验建立的氢化物发生-原子荧光光谱法测定饲料用香菇菌糠中硒含量的测定方法，不仅灵敏度高，重复性好，准确度高，而且操作简单、安全，通过该方法测定河北省三个不同食用菌产区的饲料用香菇菌糠中硒的含量，为香菇菌糠在饲料中的进一步应用提供理论基础。