凝结芽孢杆菌药敏实验的研究

2020-08-12柳成东于晓东王乙茹程志斌白华毅钱锦花PhouthapaneVanhnaseng

饲料工业 2020年14期

柳成东于晓东王乙茹程志斌* 白华毅钱锦花赵平 Phouthapane Vanhnaseng

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.大连市普兰店区星台动物卫生监督所，辽宁大连116200；3.玉溪农业职业技术学院，云南玉溪653100；4.老挝科技部生物技术与生态研究所，老挝万象2279）

近三年来我国农业农村部颁布了多项畜禽养殖“减抗、禁抗”法规条例，促成了益生菌、天然植物提取物等“替抗”产品在饲料与养殖过程中的应用（王乙茹等，2018；葛长荣等，2019）。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是芽孢杆菌属、乳酸菌类益生菌（Konuray等，2018；夏涛等，2019a），因其具备乳酸杆菌产酸抑菌以及枯草芽孢杆菌耐热适合饲料制粒的共同优势（程志斌等，2017；杨保和等，2018），在畜禽饲料替抗领域得到了越来越多的关注（黄遵锡等，2017；Wu等，2018；王乙茹等，2019a）。然而，凝结芽孢杆菌作为一种肠道发挥益生作用的革兰氏阳性菌，本课题组（夏涛等，2019b；王乙茹等，2019b）以及他人的动物试验（Hung 等，2012）表明：与其他益生菌一样，饲用凝结芽孢杆菌改善畜禽生产性能的效果可能会受到饲料中抑菌药物的干扰。进一步而言，饲料禁抗后提高了畜禽感染各类疾病的风险，养殖过程中抗生素及抗寄生虫类的保健和治疗性药物投入的频率和数量显著增加，这也可能影响饲用凝结芽孢杆菌发挥益生效果（Barba-Vidal 等，2018；Liu 等，2018）。依据当前我国农业农村部的最新规定：金霉素、吉他霉素等部分抗生素可以在养殖场拌入饲料或饮水作为保健预防药物使用，维持动物健康；此外，抗球虫类药物依然可以在肉鸡及后备蛋鸡的商业全价配合饲料中添加，且这些抗球虫药物均可作为保健预防药物在肉鸡、蛋鸡养殖过程中拌入饲料或饮水使用。

由此可见，开展凝结芽孢杆菌药敏实验，评估畜禽养殖投入药物对凝结芽孢杆菌饲用效果的影响，完善凝结芽孢杆菌在畜禽养殖领域的关键应用技术，可以实现未来在无抗饲料与无抗养殖条件下，凝结芽孢杆菌更稳定地发挥益生效果。鉴于目前没有针对凝结芽孢杆菌药敏实验的系统详细报道，本研究具有一定的科学和生产价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 凝结芽孢杆菌

课题组从云南省曲靖市富源县农村散养的地方品种猪“大河猪”肠道中，分离出一株产乳酸的芽孢杆菌，该菌株经过课题组系统的理化分析与16s RNA鉴定为凝结芽孢杆菌，命名凝结芽孢杆菌YNAU 3127，并用于本次实验。

1.1.2 目标药物

从我国农业农村部公告第168 号《饲料药物添加剂使用规范》中挑选了4 类（抗革兰氏阴性菌、抗革兰氏阳性菌、广谱抗菌、抗球虫）16 个目标药物，进行药敏实验（表1）。目标药物添加剂由饲料生产企业提供。

表1 目标药物

依据《饲料药物添加剂使用规范》中各类药物饲料添加剂的允许添加剂量范围（该药物添加的上限与下限剂量），采用了“低剂量、中剂量、高剂量”3个浓度（表2），来评估药物对凝结芽孢杆菌YNAU 3127的抑制效应。

表2 目标药物的溶解试剂及抑菌剂量

1.2 牛津杯法实验步骤及评估方法

1.2.1 凝结芽孢杆菌的培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g、NaCl 2.5 g、CaCl20.15 g、MnSO4·H2O 0.1 g、番茄粉0.5 g、琼脂2%。

1.2.2 凝结芽孢杆菌的MRS平板制备

将MRS 固体培养基在121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min 后，并冷却至37 ℃左右后倒入培养皿内，约20～25 ml。凝固后待水分干燥，即可涂布。

1.2.3 凝结芽孢杆菌的培养

从培养皿中挑取单一菌落到装有100 ml 的MRS培养液的三角锥形瓶中，置于摇床24 h 后，吸取1 ml的凝结芽孢杆菌活菌液到装有100 ml的无菌水中，置于摇床30 min。随后，取出锥形瓶，将菌液稀释到10-5作为涂布菌液。

1.2.4 放置牛津杯

将菌液涂干后，在每个培养皿中放置3个牛津杯（分别表示低剂量、中剂量、高剂量）。然后，在3个牛津杯中加入100 μl的不同剂量药物饲料添加剂溶液。

1.2.5 恒温培养

将加完抗生素的培养皿放置到40 ℃的恒温培养箱中，培养48 h。

1.2.6 药敏结果判定

以牛津杯法的抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ）判定药敏性。抑菌圈直径的测定如下：用游标卡尺测量抑菌圈直径的最大值与最小值，以二者的平均值确定抑菌圈直径（单位mm）。

药敏性结果判定标准如下：“不敏感”，DIZ=0 mm；“中敏感”，0 mm＜DIZ≤16 mm；“敏感”，DIZ＞16 mm。

1.3 统计方法

数据用“平均值±标准差”表示。同一药物的不同剂量之间进行单因素方差分析和LSD多重比较，SPSS软件进行统计分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

表3结果显示：凝结芽孢杆菌YNAU 3127对金霉素和土霉素2 个广谱抗菌药物，判定为“敏感”水平（DIZ＞16 mm，表3、图1和图2），且金霉素和土霉素的DIZ 值均表现为：高剂量＞中剂量＞低剂量，统计达到差异显著水平（P＜0.05）。此外，该凝结芽孢杆菌对硫酸黏杆菌素、喹烯酮、恩拉霉素、吉他霉素、黄霉素、杆菌肽锌、亚甲基水杨酸、阿维拉霉素、那西肽等9个药物，均判定为“不敏感”（DIZ=0 mm）。

表3 凝结芽孢杆菌的药敏实验结果(抑菌圈直径，mm)

图1 金霉素对凝结芽孢杆菌的抑制效果

图2 土霉素对凝结芽孢杆菌的抑制效果

该株凝结芽孢杆菌对甲基盐霉素、莫能菌素2个抗生素类的抗球虫药物，判定为“敏感”水平（DIZ＞16 mm，表3 和图3）。该菌对高剂量的盐霉素判定为“敏感”（DIZ＞16 mm，表3 和图3），但对低、中剂量的盐霉素只达到“中敏感”水平（0 mm＜DIZ≤16 mm，表3 和图3）。此外，该株凝结芽孢杆菌对地克珠利、尼卡巴嗪2 个化学合成类的抗球虫药物，判定为“不敏感”（DIZ=0 mm）。

图3 抗球虫药物对凝结芽孢杆菌的抑制效果

3 讨论

牛津杯法是体外评估细菌对抑菌药物的药敏性的公认实验方法，此法具有直观的优点（张学沛等，2014）。当然，牛津杯法也有一定的缺陷，因为评估的目标药物及其浓度不同、细菌的数量级差异等因素会影响抑菌圈直径（DIZ），使药敏性判定标准很难统一，可能导致药敏性结论的差异（张煜等，2011）。目前，凝结芽孢杆菌药敏实验的报道很少，且无统一的药敏性判定标准（赵丽娜，2017；严涛等，2018）。赵丽娜（2017）评估了庆大霉素、氟苯尼考等10个常用兽药抗生素对凝结芽孢杆菌的抑菌效果，其药敏实验判定标准是：“低度敏感”，DIZ＜10 mm；“中度敏感”，10 mm＜DIZ≤18 mm；“高度敏感”，DIZ＞18 mm。本实验针对饲用药物添加剂的药敏判定标准如下：“不敏感”，DIZ=0 mm；“中敏感”，0 mm＜DIZ≤16 mm；“敏感”，DIZ＞16 mm。本研究与赵丽娜（2017）药敏判断标准的最大区别在于“不敏感”的判定。此外，依据本实验所用的牛津杯（7.8 mm），将牛津杯外径的2 倍16 mm界定为本实验“中敏感”与“敏感”的区分。

表3 结果显示，金霉素、土霉素对凝结芽孢杆菌YNAU 3127的DIZ值分别为48～58 mm与33～39 mm，判定为“敏感”。赵丽娜（2017）研究显示，土霉素对凝结芽孢杆菌的DIZ=37 mm。赵丽娜（2017）从兽药抗生素角度评估的结果与本实验从药物饲料添加剂角度评估的结果基本一致，共同说明：本研究创新采用的牛津杯法，适合于凝结芽孢杆菌的药敏实验评估。

甲基盐霉素、莫能菌素、盐霉素、尼卡巴嗪、地克珠利等是畜禽常用的抗球虫药物，应用于饲料添加剂和保健兽药，尤其是饲料“禁抗”后，抗球虫药物只能用于定期驱虫保健或兽药治疗（Noack 等，2019）。表3 结果显示：该株凝结芽孢杆菌对甲基盐霉素、莫能菌素以及高剂量的盐霉素，判定为“敏感”水平；对低、中剂量的盐霉素判定为“中敏感”；对化学合成类的抗球虫药物地克珠利和尼卡巴嗪“不敏感”。以上结果表明，凝结芽孢杆菌对不同类型及其剂量的抗球虫药物的药敏性不同。这提示未来无抗饲料的养殖生产中，如果畜禽饲粮中添加了凝结芽孢杆菌，养殖过程就要科学选用抗寄生虫药物，规避“配伍禁忌”。

此外，该凝结芽孢杆菌对2个抗革兰氏阴性菌药物（硫酸黏杆菌素、喹烯酮）以及7个抗革兰氏阳性菌药物（恩拉霉素、吉他霉素、黄霉素、杆菌肽锌、亚甲基水杨酸、阿维拉霉素、那西肽），判定为“不敏感”。课题组依据这一药敏实验结果，完成的饲养试验表明（王乙茹等，2019b）：肉鸡饲料中凝结芽孢杆菌可以与阿维拉霉素组合使用，且生长性能优于单一使用阿维拉霉素。因此，现有的体内（王乙茹等，2019b）、体外试验（表3）均证明：如果饲粮是添加了凝结芽孢杆菌的无抗饲料，畜禽养殖过程中治疗和保健药物的选用需要考虑科学配伍，这样才能发挥药物以及补充有益菌凝结芽孢杆菌的共同效果。