气相色谱法同步测定饲料中的4 种香味物质

王 石 王钦钦，2 胡 深 肖志明 刘晓露 田 静 樊 霞*

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京100081；2.青岛市华测检测技术有限公司，山东青岛266101；3.湖北省饲料监测所，湖北武汉430070）

饲料用香味剂是一类利用畜禽嗅觉、味觉等生理 学原理，用来改善和增强饲料天然口味与气味，促进采食、生长的饲料添加剂[1]。《饲料添加剂品种目录（2013）》（中华人民共和国农业部公告第2045号）中规定了在养殖动物中允许使用的饲料用香味剂种类（其中包含了GB 2760中允许使用的食品用香料）。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛作为目前应用较为广泛的重要食用香料，已被逐步推广并应用于饲料及饲料添加剂生产中。香芹酚（Carvacrol，分子式为C10H14O，分子量152.2）和百里香酚（Thymol，分子式C10H14O，分子量152.2）是一对同分异构体，具有特殊的百里香和麝香草香气，天然存在于百里香、牛至精油中，具有宜人香气和很强的杀菌作用[2-4]。丁香酚（Eugenol，分子式C10H12O2，分子量164.2）具有浓郁的石竹麝香气味，能增加饲料香味，引诱动物进食[5]。肉桂醛（Cinnamal⁃dehyde，分子式为C9H8O，分子量132.2）是一种醛类有机化合物，黄色黏稠状液体，大量存在于肉桂等植物体内，具有强烈的桂皮和肉桂特有香气。肉桂醛具有很好的抗霉杀菌作用，添加了肉桂醛的饲料，能保存很长时间不发霉、不变色变味[6-8]。由于具有一定的促进生长、改进饲料效率以及控制禽畜细菌性下痢、防止饲料霉变等功能，香芹酚、肉桂醛等多种香味物质在饲料中的推广及应用日益增加，已成为了一类重要的饲料添加剂。关于饲料香味剂的检测技术已有诸多报道[9-14]，但现有报道中多限于1～2种香味剂的测定，多种香味物质同步联检的方法报道不多。建立饲料及饲料添加剂中多种香味成分的联检方法，对香味成分进行定量检测，有助于规范饲料香味剂产品市场，并为合理使用饲料香味剂产品提供技术支撑。本文在前人研究的基础上，通过对样品前处理方法与色谱分离条件进行优化，建立了气相色谱同时测定饲料及饲料添加剂中香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛等4种香味物质含量的定量分析方法。该方法具有检测时间短、前处理操作简便、灵敏度高等特点，满足大部分饲料产品的检测需求，能对市场上存在的该类产品进行质量评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供实样品

市售饲料、饲料添加剂及添加剂预混合饲料样品均由国家饲料质量监督检验中心（北京）在全国范围采集获得。

1.1.2 仪器和设备

6890N型气相色谱仪，配有FID检测器（美国Agi⁃lent公司）；SK5200LHC型超声波清洗器（上海科导超声器有限公司）；Himac CF 16RX型高速离心机（日本Hitachi公司）；MS3 digital 型涡漩混匀器（德国IKA公司）；Million-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.1.3 试剂和溶液

乙醇、乙腈、乙醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（30～60 ℃）（分析纯，国药集团）；实验用水为超纯水；肉桂醛、百里香酚、香芹酚和丁香酚对照品（美国Sigma-Aldrich 公司，纯度≥99.0%）；1.0 mg/ml 混合标准储备液（95%乙醇配制，在2～8 ℃之间避光储存，有效期1 个月）；1.0、5.0、10.0、50.0、100、500 μg/ml 混合标准工作溶液（95%乙醇配制，现用现配）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取2.5 g 样品（精确至0.000 1 g），将其置于50 ml聚丙烯离心管中。加入约2.5 ml水将样品浸湿，再加入20 ml无水乙醇，振荡混匀后于超声波清洗机中超声提取20 min。10 000 r/min 离心5 min，收集上清液置于50 ml 容量瓶中。残渣用20 ml 无水乙醇重复提取一次，合并2 次提取液，无水乙醇定容后充分混匀，用0.45 μm有机滤膜过滤后上机检测。当溶液中香芹酚、肉桂醛等物质的含量在标准曲线范围之外时，需用吸量管移取一定体积的上述样品溶液，用95%乙醇稀释至标准曲线的线性范围。

1.2.2 色谱分离条件

毛细管色谱柱：Agilent HP-Innowax，30 m×0.32 mm×0.25 μm；升温程序：初始温度80 ℃，以12 ℃/min 的速率升温至140 ℃，以6 ℃/min 升温至170 ℃，保持3 min，以25 ℃/min升温至240 ℃；进样口温度：240 ℃；检测器：FID检测器；检测器温度：260 ℃；进样量：1.0 ml；分流比：10∶1；载气：氮气。

2013年11月召开的十八届三中全会提出了我国要进行全面深化改革。近年来，国务院也提出了“放管服”的改革思路。在这一政治背景下，我国招标代理也面临着行业改革。

1.2.3 定性定量检测

在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与混合标准品工作液中对应的保留时间相差在±0.2 min 之内，则可判定为样品中存在对应的待测物。在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和标准溶液分别进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，被测组分浓度为横坐标，绘制标准曲线。外标法计算样品中香芹酚等组分的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

2.1.1 气相色谱柱选择

气相色谱技术主要是利用物质的沸点、极性及对固定相吸附性质的差异来实现混合物的分离。由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都在流动相和固定相之间进行反复多次的分配或吸附/解吸，在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出，从而达到了分离的目的[15]。气相分离主要受目标物的汽化难易程度和分子对固定相的吸附影响。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛等皆为小分子弱极性化合物，沸点在232～255 ℃之间。又因4种化合物都具有含氧基团，因此适合使用中等极性或极性色谱柱对其进行分离。在现有研究基础上，选择了3种不同的极性色谱柱对4种香味物质进行分离测定。实验中的载气流量及升温程序等条件参考了董茂锋等[16]、李会荣等[17]撰写的相关文献，在较优色谱条件的基础上得到的结果见表1。

通过实验考查表1中不同型号的毛细管色谱柱，并对相邻两色谱峰间的分离度、保留时间与色谱峰形等参数进行比较，研究发现使用HP-Innowax 毛细管色谱柱的分离效果最佳（香芹酚与百里香酚的分离度R=2.9），分析时间较长。FFAP 色谱柱分析时间与HP-Innowax 相似，但分离度明显降低。而毛细管色谱柱DB-5 的分析时间最短，其只能使香芹酚和百里香酚基本分离，目标峰拖尾，峰形较差。综合分离度、保留时间、峰形等因素，实验选择了HP-Innowax毛细管色谱柱作为固定相，进一步研究升温程序对分离效果的影响。

表1 香芹酚和百里香酚在不同色谱柱上的分离度

2.1.2 升温程序确定

气相升温程序是影响色谱峰分离度和保留时间的另一个重要参数，实验对不同升温程序进行考察。固定色谱柱型号、载气流速等条件，改变升温程序，所得分离结果见表2。表2中的R为香芹酚和百里酚的分离度，T 为毛细管色谱柱中出峰顺序最晚组分（香芹酚）的保留时间。

表2 升温程序对色谱分离的影响

2.2 样品前处理方法优化

2.2.1 提取方式优化

称取2.5 g 空白配合饲料样品进行标准添加（添加浓度为100 mg/kg），以该饲料为待测样品，乙醇为提取溶剂，考察了超声提取和索氏提取两种提取方式对饲料样品中香芹酚等物质提取效率的影响。将超声提取时间设定为20 min，重复提取2 次，索氏提取时间设定为40 min。2 种方式提取得到的溶液在50 ml 容量瓶中定容后上机检测，结果见图1。

由图1 可以看出，在提取时间相同的情况下(40 min)，两种提取方式得到的丁香酚、百里香酚、香芹酚等三种香味物质的收率都可达90%左右；而肉桂醛在高温下不稳定，容易发生氧化反应，索氏提取的回收率仅为58%，相较之下，超声提取的效率更高，回收率可达76%。因此，最终选取超声提取作为样品前处理方法。

图1 不同提取方式对回收率的影响

2.2.2 提取溶剂的选择

适合的提取溶剂有利于提高样品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的提取效率，实验考察不同提取溶剂对香味剂提取效率的影响。称取2.5 g空白配合饲料样品进行标准添加（添加浓度为100 mg/kg），以该饲料为待测样品。选择了7种常规有机溶剂，通过超声提取，比较石油醚、正己烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇和乙腈对待测样品中各香味剂的提取效率，所得结果见图2。

由图2 可以看出，对于香芹酚、百里香酚和丁香酚3组分，7种溶剂中乙酸乙酯的提取效率最佳，当乙酸乙酯为溶剂时，香芹酚等3组分的回收率明显高于其他6 种试剂；而石油醚的提取效率最低，其对百里香酚、香芹酚提取的回收率已低于80%；乙醇等5 种溶剂的提取效率介于乙酸乙酯和石油醚之间，且这5种溶剂的提取效率没有显著差别。而对于肉桂醛，乙腈和石油醚的提取效率较低，回收率仅为60%左右，乙醇、乙酸乙酯等5种溶剂的差异不显著。

图2 不同提取溶剂对回收率的影响（配合饲料基质添加）

而对于水溶性包被的饲料香味剂样品（为防止香味物质挥发，饲料中常用淀粉、果胶包被香味组分），7 种溶剂的提取效率均较低，测量值仅为标示量的50%～60%，这严重影响了样品的检测结果。实验发现，当使用少量的去离子水作为破壁剂对样品进行润湿，然后使用乙醇作为提取溶剂，该方式对以果胶包被的水溶性样品具有很好的效果，其回收率皆高于75%。因此提取溶剂选择：加入少量的水润湿样品，再加入乙醇超声提取。

2.2.3 提取温度影响

有文献报道，香芹酚、百里香酚等酚类化合物具有较好的热稳定性，80 ℃以上加热处理，饲料、制剂、产品中有效成分损失仅为0.79%[18]。而肉桂醛却因含有醛基基团，在饲料中存在微量金属元素的条件下易发生催化氧化，因此在高温处理时易造成损失。针对该特性，实验对提取温度进行优化，考察温度对各香味物质的影响，结果见图3。

由图3可知，通过对比25 ℃、45 ℃和65 ℃条件下的提取效果，实验发现提取温度对香芹酚、百里香酚和丁香酚的影响并不显著，但高温却使得肉桂醛的收率急剧降低。65 ℃条件下，香芹酚、百里香酚等3 种香味物质的收率未有显著变化（回收率皆大于90%）。而肉桂醛在65 ℃条件下，其回收率减低到50%～60%。因此，同时考虑4种香味物质的回收率和基质干扰，最终选择的提取温度为室温。

图3 不同提取温度对回收率的影响

2.2.4 提取时间影响

称取2.5 g 空白配合饲料样品进行标准添加（添加浓度为100 mg/kg），以该饲料为待测样品，考察超声提取时间对香味剂回收率的影响，结果见图4。在提取时间方面，香芹酚、百里香酚和丁香酚等香味物质的含量随着提取时间延长略有而增加，当超声提取5 min 时，回收率约为85%；随着时间的延长到20 min，回收率进一步增加，达到94%左右；继续延长提取时间，回收率变化并不显著。而随着超声提取时间的延长，样品中肉桂醛逐渐损失，当20 min时，其回收率已低于80%（见图4）。因此，综合考量4 种香味成分的提取效率，最终我们选择的提取时间为20 min，重复提取2 次。

图4 不同提取时间对回收率的影响

2.3 线性关系

配制浓度为1.0～500 μg/ml 的香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛标准溶液，以1.2.2色谱分离条件进行检测，以色谱峰面积和标准溶液浓度作标准曲线，线性实验结果见表3。

从表3中可以看出：香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛标准溶液在1.0～500 μg/ml 的范围内线性相关系数均大于0.999，线性关系良好。

表3 香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛对照溶液线性实验

2.4 方法检测限

实验对方法的检测极限进行探讨，随机抽取不同来源的20份饲料样品，按照1.2所述方法进行样品处理和测定，代表性的空白及添加样品色谱图如图5所示。在目标化合物的保留时间内没有干扰峰的出现，表明该方法的选择性良好。根据20个空白样品的基线噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3 为检出限（Limits of Detection，LOD），S/N=10 为定量限（Limits of Quantification，LOQ），肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚等4 种化合物的LOD、LOQ 分别为10 mg/kg 和20 mg/kg。

图5 4种香味物质标准溶液（a, 150 μg/ml）、添加饲料样品（b, 100 mg/kg）及空白样品（c）色谱图

2.5 方法准确度与精密度

选择具有代表性的饲料样品，包括鸡配合料、奶牛精料补充料、仔猪预混料进行添加回收试验，以考察方法的准确度和重现性。按照1.2 所述方法进行样品处理和测定，方法的准确度、精密度见表4。

由表4 可以看出，不同基质中4 种香味剂的回收率为：75.9%～108.5%，符合在一定浓度水平上的回收率范围；方法的相对标准偏差RSD≤8.1%。

表4 不同饲料中添加香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛的回收率及精密度（n=6，%）

2.6 实际样品检测

通过建立方法对市场上收购的3 种饲料样品进行检测，检测结果见表5。

由表5可以看出，样品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的测定值与标示值基本一致(以标示量为约定值，则测定值与约定值的相对误差值均不大于8.3%)，该方法可以满足对实际样品的检测。

表5 饲料样品的测定结果

3 结论

本文建立了气相色谱同步测定饲料中肉桂醛、丁香酚、百里香酚和香芹酚含量的分析方法。通过建立方法进行分析，4种香味剂在15 min内可实现气相色谱基线分离。方法的检出限为10 mg/kg，定量限为20 mg/kg，平 均 回 收 率 为75.9%～108.5%，RSD≤8.1%。该方法具有检测时间短、前处理操作简便等特点，可以满足对饲料中香芹酚、丁香酚、百里香酚和肉桂醛含量的同步检测。