3种药敏检测方法对洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏结果分析

李 莹，陶运娟，徐 杰，任亚璐，陈 旭

1.南京中医药大学附属盐城市中医院检验科，江苏盐城 224000；2.苏州大学附属第一医院检验科，江苏苏州 215000

洋葱伯克霍尔德菌是一种常见的医院获得性感染条件致病菌，包括新洋葱伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、稳定伯克霍尔德菌、污染伯克霍尔德菌等[1]。洋葱伯克霍尔德菌可引起免疫缺陷患者的严重感染，尤其是在囊性纤维化患者中；还可引起以坏死性肺炎、败血症和整体预后差为特征的“洋葱综合征”[2]。由于临床上抗菌药物和免疫抑制剂的广泛使用，使得洋葱伯克霍尔德菌对抗菌药物多重耐药甚至全耐药[2-3]。碳青酶烯类亚胺培南及3代头孢菌素的使用会增加洋葱伯克霍尔德菌检出和定植的发生。本研究以微量肉汤稀释法为参考方法，评估纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌体外抗菌药物药敏试验的结果。

1 材料与方法

1.1临床菌株 收集2017年3月至2018年8月从苏州大学附属第一医院临床分离的洋葱伯克霍尔德菌30株，从盐城市第三人民医院分离1株，共31株为研究对象。其中来自痰15株(48.39%)，咽拭子10株(32.25%)，全血3株(9.68%)，引流液1株(3.23%)，伤口1株(3.23%)，分泌物1株(3.23%)。通过质谱仪鉴定31株伯克霍尔德菌属，其中多噬伯克霍尔德菌15株(48.39%)，洋葱伯克霍尔德菌13株(41.93%)，越南伯克霍尔德菌1株(3.23%)，污染伯克霍尔德菌1株(3.23%)，新洋葱伯克霍尔德菌1株(3.23%)。同一患者同一标本中多次分离的相同菌株不重复计数。

1.2质控菌株 铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922。

1.3仪器与试剂 法国梅里埃公司的VITEK MS全自动微生物质谱鉴定仪和法国梅里埃公司的VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统，微量肉汤稀释法和E-test法药敏试剂均购自温州市康泰生物科技有限公司，纸片扩散法药敏试剂购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.4药敏结果判定及标准 按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100 28th抗微生物药敏试验的执行标准进行操作及药敏结果判读，其中头孢哌酮/舒巴坦纸片扩散法、微量肉汤稀释法、E-test法最低抑菌浓度(MIC)值参考肠杆菌头孢哌酮折点标准。以微量肉汤稀释法为参考方法，基本一致率(EA)为被评估方法的MIC值与微量肉汤稀释法MIC值相差不超过1个稀释度的菌株百分比；分类一致率(CA)为被评估方法的药敏结果(敏感、中介、耐药)与微量肉汤稀释法一致的菌株百分比；非常重大误差(VME)为被评估方法将耐药报告为敏感；重大误差(ME)为被评估方法将敏感报告为耐药；小误差(MI)为被评估方法将中介报告为耐药或敏感，或将耐药、敏感报告为中介。可接受范围：CA≥90.0%，EA≥90.0%，VME≤1.5%，ME≤3.0%，MI≤10.0%[4]。

1.5统计学处理 本研究采用Excel进行数据分析；计数资料以率(%)进行描述性统计分析。

2 结 果

2.1抗菌药物MIC值和敏感率 复方磺胺甲噁唑是体外抗洋葱伯克霍尔德菌群最有效的抗菌药物50%MIC(MIC50)为1.00 μg/mL，敏感率为100.0%；然后是米诺环素，MIC50为1.00 μg/mL，敏感率高达96.8%；美罗培南MIC50为4.00 μg/mL，敏感率为90.3%；头孢他啶和左氧氟沙星MIC50分别为2.00、1.00 μg/mL;敏感率均为83.8%；而头孢哌酮/舒巴坦MIC50为16.00 μg/mL，仅仅只能抑制61.3%的洋葱伯克霍尔德菌生长。复方磺胺甲噁唑、米诺环素和美罗培南3种检测方法的体外敏感率比较接近，且敏感率均>90.0%；而头孢他啶和头孢哌酮/舒巴坦的微量肉汤稀释法敏感率却低于E-test法和纸片扩散法；左氧氟沙星的微量肉汤稀释法敏感率高于E-test法。见表1。

表1 31株洋葱伯克霍尔德菌对6种抗菌药物的MIC和敏感情况

2.26种抗菌药物的误差率 以微量肉汤稀释法为参考方法，纸片扩散法检测6种抗菌药物中美罗培南和复方磺胺甲噁唑的误差最小，VME和ME均为0.0%，MI为9.7%；米诺环素的VME最高，达6.5%；头孢哌酮/舒巴坦的ME为12.9%，MI为16.1%；头孢他啶MI为12.9%，略高于标准。见表2。

表2 纸片扩散法检测的误差率和CA

以微量肉汤稀释法为参考方法，E-test法检测6种抗菌药物中美罗培南、米诺环素和复方磺胺甲噁唑无误差，头孢他啶的误差比较小，ME为3.2%，MI为6.5%；头孢哌酮/舒巴坦的误差最大，ME为12.9%，MI为12.9%；左氧氟沙星的误差率略高，MI为6.5%,VME为6.5%。见表3。

表3 E-test法检测的误差率和CA

2.36种抗菌药物的EA%和CA% 在log2(-1～1)范围内，以微量肉汤稀释法为参考方法，E-test法检测美罗培南和复方磺胺甲噁唑的EA为>90.0%,头孢哌酮/舒巴坦的EA为80.5%，米诺环素和头孢他啶的EA为74.1%、77.4%，左氧氟沙星仅为67.7%。美罗培南、复方磺胺甲噁唑和米诺环素3种方法的CA均>90.0%，左氧氟沙星的CA范围为83.8%～100.0%，头孢他啶的CA范围为83.8%～87.1%。见表2～4。

表4 在log2(-1～+1)范围内E-test法基本一致率

3 讨 论

洋葱伯克霍尔德菌是引起医院感染的重要致病菌[5]，包括菌血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、脓肿等，同时也是引起肺囊性纤维化和慢性肉芽肿的重要致病菌[6]。目前，临床上分离到的洋葱伯克霍尔德菌越来越多，在非发酵革兰阴性杆菌中位于第4位，仅次于不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌[7]。洋葱伯克霍尔德菌对许多抗菌药物天然耐药，且耐药机制比较复杂。一些国内外学者认为洋葱伯克霍尔德菌的耐药机制主要为[2,8-9]：(1)细胞膜渗透性降低；(2)细胞的主动外排；(3)通过底物裂解或化学修饰使酶失活；(4)点突变引起的靶点改变、减少或缺失；(5)以耐药靶替代易感目标，进行代谢旁路；(6)通过增加转录或基因增殖使产生的靶点过量；(7)特异性结合蛋白的药物隔离作用。为及时准确地报告药敏结果，指导临床合理用药，本研究采用法国梅里埃公司的VITEK MS全自动微生物质谱鉴定仪鉴定并确认洋葱伯克霍尔德菌。通过微量肉汤稀释法、E-test和纸片扩散法来检测洋葱伯克霍尔德菌的药敏结果。

微量肉汤稀释法被认为是“金标准”[10]。纸片扩散法具有操作简单、价格便宜等优点，在日常的药敏试验工作中应用非常广泛。本研究显示，纸片扩散法和E-test法检测洋葱伯克霍尔德菌对复方磺胺甲噁唑无论是MIC50、敏感率、误差率、EA,还是CA结果都很好，但从操作和经济方面考虑，纸片扩散法最适宜。复方磺胺甲噁唑和米诺环素敏感性最好，与文献报道一致[11-12]。但是米诺环素纸片扩散法的VME较高(6.5%)，与茅国峰等[13]研究报道纸片扩散法结果不一致，主要原因为：(1)四环素类药物纸片扩散法存在中介和耐药假性增高的问题，这是由四环素类药物的化学性决定的；(2)此次研究的菌株数量比较少，可能存在随机误差。因此，为了结果的准确性，应该扩大研究菌株的数量。同时，有资料表明，米诺环素对人体的伤害性较大，临床用此药应当慎重[14]。左氧氟沙星由于2017年CLSI取消了纸片扩散法的折点，所以只能测定其MIC值。头孢他啶尽管纸片扩散法MI略高，为12.9%，但是MIC50、敏感性、CA和误差比较小，可能是标本量比较少的原因，存在随机误差。头孢哌酮/舒巴坦的CA<90.0%，与茅国锋等[13]研究结果一致，头孢哌酮/舒巴坦的ME>3.0%，MI>10.0%,可能与没有具体的CLSI折点有关。

综上所述，临床上有洋葱伯克霍尔德菌感染者，E-test法、纸片扩散法检测洋葱伯克霍尔德菌体外药敏试验结果显示，不同的方法检测可能存在不同的误差，应合理选择药敏检测方法，以确保结果的准确性。