实时荧光定量PCR在高危型HPV感染检测中的应用价值

樊晓阳

(新野县人民医院 检验科，河南 南阳 473500)

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)为乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，HPV感染较常见。据相关数据统计，60%～70%女性感染过HPV，99.8%宫颈癌患者HPV检测呈阳性[1-2]。大量研究结果表明，HPV感染在女性宫颈疾病发生发展中具有关键作用，而高危型HPV感染为癌前病变、宫颈癌发生的必要条件，及早检测诊断是疾病防治的关键[3-4]。第二代杂交捕获试验(hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ)为近年来临床常用诊断技术，相对于第一代杂交捕获试验，HC-Ⅱ检测工作效率更高，成本更低，适用于高危HPV感染筛查，并具有一定诊断效果，但在鉴别病变类型等方面整体效果欠佳。随着分子医学的发展，PCR检验技术在临床得到广泛关注，实时荧光定量PCR作为新型核酸定量检测方法，将普通PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性、光谱技术高精确性进行有机结合，克服了传统PCR的不足，检测差异性较小，检测结果具有良好相关性。基于此，本研究对198例高危型HPV感染患者的临床资料进行回顾性分析，探讨实时荧光定量PCR检验的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年2月至2019年12月新野县人民医院收治的198例高危型HPV感染患者，年龄27～69岁，平均(36.75±4.52)岁，体质量指数17～25 kg·m-2，平均(22.16±1.05)kg·m-2，67例患者存在不同程度宫颈病变，其中宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN) Ⅰ级36例，CIN Ⅱ级21例，CIN Ⅲ级10例，64例为鳞状上皮病变和慢性宫颈炎。

1.2 选取标准

1.2.1纳入标准 (1)已婚或有性生活史女性；(2)一般资料完整；(3)依从性良好，可配合检查；(4)无沟通交流障碍；(5)同时接受实时荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测。

1.2.2排除标准 (1)合并其他生殖系统疾病；(2)存在认知障碍或既往有严重精神疾病；(3)合并生殖系统或其他系统传染性疾病。

1.3 检测方法

1.3.1实时荧光定量PCR检验 使用扩阴器充分暴露宫颈口，使用棉拭子擦拭干净分泌物，将宫颈刷缓慢送至宫颈口，逆时针转动4～5圈，后将宫颈刷置入含有保存液的洗脱管中，做好标记，管盖旋紧，折断宫颈刷，使刷头留置在管中。将收集的宫颈脱落细胞标本置入微量离心管(1.5 mL)，离心(13 000 r·min-1，10 min)处理，弃上清液，加入50 μg裂解液悬浮沉淀，100 ℃环境下加热10 min，离心(13 000 r·min-1，10 min)处理，保留上清液，待用。PCR扩张，50 ℃ 15 min，90 ℃ 10 min，40个55～95 ℃循环，使模板DNA加热到95 ℃，双链DNA解离为单链。将PCR产物加入杂交缓冲液，沸水浴变性10 min，51 ℃环境下，杂交1 h，洗脱15 min。POD孵育洗涤，显色。循环阈值(cycle threshold，Ct值)<37为阳性，反之为阴性。

1.3.2HC-Ⅱ检测 使用Digene公司的HPV DNA检测试剂盒，行细胞标本双链解链操作，采用RNA探针行杂交处理，后生成杂交体与特异性抗体结合，结合发光强度、大小定量测定，计算负荷量。HPV负荷量≥1.0 μg·L-1即为阳性，反之为阴性。

1.4 观察指标(1)实时荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测HPV阳性检出率和符合率。(2)实时荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测不同病变类型检出情况。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件处理数据，计数资料(阳性检出率、符合率、不同病变类型检出率)以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，采用Kappa指数进行一致性检验，其中Kappa指数>0.75表示一致性极好，Kappa指数0.4～0.75表示一致性较好，Kappa指数<0.4表示一致性差。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 阳性检出率和符合率实时荧光定量PCR检验HPV阳性检出率(75.25%)较HC-Ⅱ检测(62.63%)高，差异有统计学意义(P<0.05)；实时荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测符合率为83.33%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 阳性检出率和符合率

2.2 不同病变类型检出情况实时荧光定量PCR检验和HC-Ⅱ检测CIN Ⅰ级、CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级宫颈病变检出率比较，差异无统计学意义(均P>0.05)；实时荧光定量PCR检验鳞状上皮病变和慢性宫颈炎检出率较HC-Ⅱ检测高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 不同病变类型检出情况[n(%)]

3 讨论

宫颈癌为妇科常见恶性肿瘤，在女性生殖器官恶性肿瘤中占50%以上，在女性相关癌症中致死率仅次于乳腺癌，HPV在宫颈癌患者中多呈阳性，且病变程度越高，HPV检出率越高[5-6]。高危型HPV感染和宫颈癌关系密切，但宫颈癌癌前病变期较长，癌前病变过程中采用有效医学干预是逆转病变的关键。早期进行HPV检测，针对个体不同癌前病变阶段给予阻断性治疗，治愈率高达98%，但若在癌前病变可逆转阶段未给予干预措施，发展为癌症或扩散至其他器官，5 a存活率仅为20%，故针对高危型HPV感染早期进行临床诊断对预防宫颈癌及临床治疗有积极意义[7]。

鉴于HPV无法进行体外培养，且无合适实验动物，临床对高危HPV检测多采用形态学方法、分子生物学技术。HC-Ⅱ检测可通过抗体捕获信号、化学发光信号检测HPV感染，但因采样不正确或病毒感染水平低等因素影响，易出现假阴性，影响临床诊断结果。且HC-Ⅱ检测无法有效区分鉴别HPV具体类型，而HC-Ⅱ所存在的交叉杂交问题，易与不在混合探针中其他HPV型发生交叉反应，产生假阳性结果，在指导临床诊断治疗中整体效果欠佳。实时荧光定量PCR检验将荧光标志技术、PCR技术相结合，以基因扩增为检测的基础，检测结果不受病毒感染水平影响，对低水平病毒感染患者同样具有良好诊断效果，可提高阳性检出率，避免漏诊[8]。陈丽等[9]探讨实时荧光定量PCR检测HPV的应用价值，通过应用实时荧光定量PCR和HC-Ⅱ对宫颈组织标本进行HPV DNA检测，结果显示203例患者实荧光定量PCR检出率高于HC-Ⅱ检验。时秀云等[10]对224例高危型HPV感染患者分别进行实时荧光定量PCR检验和HC-Ⅱ检验，结果显示实时荧光定量PCR检测鳞状上皮病变和慢性宫颈炎患者检出率高于HC-Ⅱ检验。本研究针对高危型HPV感染患者采用实时荧光定量PCR检验，结果显示，实时荧光定量PCR检验HPV阳性检出率较HC-Ⅱ检测高，与上述研究结果一致。同时，本研究中实时荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测符合率为83.33%，可见荧光定量PCR检验、HC-Ⅱ检测诊断一致性较好，但与HC-Ⅱ检测相比，实时荧光定量PCR检验阳性检出率高。同时，实时荧光定量PCR检验应用全自动荧光定量扩增分析仪扩增，可减少人为扩增工作量，提高工作效率，并能避免人为因素影响检测结果准确性，可准确检测出不同亚型HPV DNA水平，准确判断患者感染状况，弥补HC-Ⅱ检测在病变类型鉴别中的不足，为临床提供更多疾病信息，指导临床诊治[10]。本研究数据还表明，实时荧光定量PCR检验鳞状上皮病变和慢性宫颈炎检出率较HC-Ⅱ检测高，表明实时荧光定量PCR可提高病变类型检出效果。

综上所述，实时荧光定量PCR、HC-Ⅱ检测应用于高危型HPV感染患者中一致性较好，但实时荧光定量PCR阳性检出率、鳞状上皮病变和慢性宫颈炎检出率较高，对临床制定针对治疗方案、改善患者预后有积极意义。