郑州市新生儿非衍生化法氨基酸和酰基肉碱参考区间的制定

王雪侠，党晨滢

(郑州市妇幼保健院 检验科，河南 郑州 453001)

新生儿遗传代谢病一般是由遗传物质或者致病基因发生改变引起的，这类疾病通常具有先天性、终身性和家族性的特点，且种类繁多，临床表现复杂多样，发病轻重不一，无特异性[1]。虽然单一病种发病率较低，但是总体发病率较高，有报道新生儿遗传代谢病的患病率在千分之五以上。部分遗传代谢病患儿若未得到及时有效的诊治，常可致残，严重者危及生命。遗传代谢病的确诊和分型常需要根据实验室结果来进行，这些检查包括特异的代谢物测定、酶活性测定、生化指标测定和基因突变检测。遗传代谢病通过早期检测、干预可以避免或减少严重并发症及神经系统的损害，串联质谱法可以同时进行几十种氨基酸和肉碱的检测。有研究表明串联质谱法在新生儿期进行检测，对遗传代谢病的早期诊断和预防有着举足轻重的作用[2]。本研究的目的在于探讨制定符合郑州市新生儿人群的氨基酸和酰基肉碱参考区间，以使筛查更科学合理。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2016年8月至2019年9月在郑州市行政区域内出生的新生儿[3]，其监护人自愿参加新生儿遗传代谢病检测且签署新生儿遗传代谢病筛查知情同意书。各助产机构采血人员严格按照《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》采集足跟血，采血时间要求为出生72 h后，7 d内，并充分哺乳8次以上，对于各种原因延迟采血者，采血时间不超过出生后20 d[4]。足跟血制成干血斑，在规定时间内冷链递送至实验室，不符合要求的血片予以退回，合格血片收入实验室。本研究的检测项目包括11种氨基酸、31种肉碱，数据均来自日常工作，符合相关规定。本研究无任何利益冲突。

1.2 仪器与试剂广州市丰华生物工程有限公司FH6000MD三重四级杆串联质谱分析系统，丰华DBS220X全自动打孔仪，丰华恒温微量振荡器，超声波清洗仪，丰华非衍生化多种氨基酸、酰基肉碱测定试剂盒[5]。

1.3 检测方法

1.3.1标本采集 所有标本均制成血斑，室温下晾干(4～6 h)。

1.3.2样品处理 使用自动打孔器将质控和标本打孔，直径约为3.0 mm，依次放入U型底微孔板中，每孔加入已配制好的萃取液100 μL，封板，在30 ℃，700 r·min-1的条件下振荡45 min，然后静置5 min，揭去封板膜，每孔转移65 μL至对应位置的V型板内，用铝箔封板覆盖，上机[6]。采用全扫描采集模式，通过IRC-Pro软件计算各分析物浓度，整理成Excel表格供分析。

2 结果

2.1 正态性检验经单样本Kolmogorov-Smirnov检验判断资料的正态性，结果显示11种氨基酸和31种肉碱为非正态分布[7]。

2.2 郑州市新生儿11种氨基酸和31种肉碱的参考范围本次研究数据为非正态分布，为了兼顾假阳性和假阴性，选取双侧95%人群所在范围作为正常参考范围，以百分位数(P2.5，P97.5)表示，统计出郑州市61 199个新生儿非衍生法遗传代谢病筛查串联质谱指标中氨基酸和酰基肉碱(表1)的医学参考范围[8]。

表1 非衍生化法氨基酸和酰基肉碱的参考范围(μmol·L-1)

续表1

3 讨论

新生儿遗传代谢病的筛查在中国已有数年历史，我国最早是从20世纪80年代开始，首先开展的医院有上海市儿科研究所、上海交通大学医学院附属新华医院，历年的群体筛查证明，新生儿遗传代谢病的筛查是一种行之有效的方法[9]。新生儿遗传代谢病在群体筛查的三级预防中目标明确，防治效果较好，可评估，获益较大。传统的新生儿遗传代谢病筛查每个项目都需要各自打取血斑，分开实验，而串联质谱筛查新生儿遗传代谢病则具有快速、简便、标本用量少(1个血斑)、检测病种多等优点。此外，非衍生化方法检测多种氨基酸、酰基肉碱时不易对环境和工作人员造成污染。2002年自串联质谱应用于新生儿遗传代谢病筛查以来，我国新生儿遗传代谢病筛查工作取得了举世瞩目的成绩，但是也伴随着一些问题，例如筛查项目不统一，各地参考范围不同等。参考范围不同会导致结果在判读方面出现差异。

通过查阅文献，本研究结果和国内其他筛查中心的参考范围有差异，考虑存在地区和环境因素，各实验室根据本地区情况制定相应的参考范围，才能够更好地筛查出高危可疑患儿。历年的筛查经验表明，制定科学合理的参考范围才能使指标更适用于临床。从全国的统计来看，新生儿遗传代谢病筛查普遍存在假阳性率偏高的情况。本研究选取2016年8月至2019年9月在郑州出生的61 199例新生儿作为观察对象，通过软件测算出11种氨基酸和31种肉碱的参考范围。另外，还根据《新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识》[10]计算了一些氨基酸和酰基肉碱的比值指标，例如常用的Arg/Orn、Arg/Phe、Phe/Tyr、C3/C2、C4/C2等37项比值，这些比值指标可以用于疾病的判断和分型。后期结合基因诊断和其他确诊实验结果再定期进行评估，以便于评价所有这些指标的适宜性。新生儿遗传代谢病筛查假阳性率较高，合理制定医学参考范围，可减少假阳性新生儿的出现，从而稳定家庭情绪，减少经济负担。遗传代谢病临床表现形式多样，发病年龄不定，多数表现不典型，缺乏特异性，全身各个器官均可受累[11]，以神经系统和消化系统的表现较为突出，其余临床表现还有急性代谢性脑病、高氨血症、代谢性酸中毒等，对于不能用一般疾病解释的临床表现，应高度怀疑为遗传代谢病。制定合理的参考范围，对遗传代谢病的筛查和诊断有着非常重要的作用，可更好地提高出生人口素质，辅助临床诊治。