运动疗法对STZ诱导的糖尿病大鼠病理损伤及骨骼肌FOXO1、GLUT4表达的影响

张新霞，谢 超，王志强，高 泓

随着经济的发展，人们的饮食结构发生着巨大的变化，糖尿病(diabetes mellitus，DM)成为一种十分常见的疾病[1]。目前我国大约有9500万DM患者[2]。研究[3]表明：每周进行1次以上的运动者糖尿病的发病率减少。运动可以调节内分泌代谢并且使得肌肉利用葡萄糖和游离脂肪酸，有效抑制餐后血糖的升高，实现调节血糖的作用。糖尿病患者多运动不仅可以增强其代谢能力，还可以降低血酮体[4]。王宏[5]的研究表明：运动还能增加体内的免疫功能，改善脑细胞的活性，增强机体对血糖的调节能力。该研究旨在探讨运动疗法对链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病大鼠病理损伤及骨骼肌FOXO1、GLUT4表达的影响，以期了解运动疗法对STZ诱导的糖尿病大鼠病理损伤及骨骼肌FOXO1、GLUT4表达的影响作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级雄性Wistar大鼠75只，购自北京维通利华公司；动物许可证号SCXK(京)2017-0022，饲养于成都中医药大学附属医院动物中心实验室。

1.2 药物与试剂链脲佐菌素(纯度>99.9%，CAS号：18883-66-4)购自上海翊圣生物科技有限公司；白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒子购自美国Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司；半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)抗体购自武汉华联科有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein, LDL)及高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein, HDL)试剂盒均购自北京中生生物试剂公司；苏木精、伊红购自武汉博士得生物有限公司；中性福尔马林、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司; TRIzol 试剂购自Thermo Fisher公司。

1.3 仪器全自动生化分析仪(型号：Sysmex-chemix-180)购自日本Furuno Electric公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；电子天平(型号：BS-124s)购自北京赛多斯仪器系统有限公司；台式离心机(型号：TDL-5)购自上海安亭科学仪器厂；光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司；切片机购自德国Leica公司；低温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司。

1.4 方法

1.4.1建立模型 按照俞韩 等[6]研究方法。将所有大鼠适应性喂养1周后，禁食1 d。将链脲佐菌素(STZ)溶解于柠檬酸的缓冲溶液中，调节pH值，使pH值保持在4左右，将配置好的STZ溶液从大鼠的尾部静脉注射，其注射量为55 mg/kg，若有死亡及时补充。36 h后测空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)，当血糖含量≥16.7 mmol/L时可以认为模型建立成功。

1.4.2分组及干预 将75只大鼠采用随机数字表法分为:健康对照组、模型组、低强度运动组、中等强度运动组和高强度运动组，每组各15只。其中健康对照组不做任何处理，正常饲养；除了健康对照组以外的60只大鼠全部制成糖尿病模型；其中模型组大鼠采用自由活动，低强度运动组所有大鼠采用低强度运动，中等强度运动组大鼠采用中等强度运动；高强度运动组采用高强度运动，所有大鼠每天运动1 h，每周6 d，连续干预28 d。具体运动方式和运动程序参考Fernando et al[7]方法：采用跑台运动，适应性训练3 d，休息1 d后正式训练。低强度运动组跑速10 m/min(相当于30%最大耗氧量)、中强度普通运动组跑速15 m/min(相当于50%最大耗氧量)、高强度运动组跑速20 m/min(相当于70%最大耗氧量)，坡度均为0。

1.4.3检测项目

1.4.3.1 HE染色观察大鼠腓肠肌 HE染色观察各组大鼠腓肠肌，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脱水、苏木精浸泡、盐酸酒精分化、冲洗、伊红染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，最后中性树胶封片、观察。

1.4.3.2 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平 取大鼠大鼠腓肠肌，使用剪刀剪碎后使用滤网过滤，制成悬液，使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提取总蛋白，半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗净，以GAPDH为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.4.3.3 生化指标检测 严格按照全自动生化检测仪使用方法检测大鼠血清TG、TC、LDL、HDL含量变化。

1.4.3.4 ELISA法检测大鼠炎症因子 从大鼠颈总动脉插管接取0.5 ml血液，按照试剂盒说明书检测大鼠血清中的IL-6、IL-10及TNF-α含量。

1.4.3.5 生物化学方法测定 使用黄嘌呤氧化酶法测定大鼠骨骼肌组织中SOD的活性[8]；使用硫代巴比妥酸法检测大鼠病骨骼肌组织中MAD含量[9]；使用生化法检大鼠病骨骼肌组织中LDH含量[10]。

1.4.3.6 基因检测 用TRIzol试剂提取各组骨骼肌总RNA，测定RNA浓度和纯度后，用反转录试剂盒合成cDNA，用PCR仪进行扩增，用SYBR PCR Master Mix试剂盒对FOXO1和GLUT4表达水平进行检测，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 HE染色腓肠肌结果健康对照组腓肠肌肌肉组织、肌外膜、肌纤维均正常；模型组大鼠腓肠肌镜下部分肌纤维弯曲，肌红蛋白溶解，肌细胞核固缩、溶解，肌束膜破裂；低强度运动组大鼠腓肠肌少量肌纤维断裂溶解弯曲，余未见异常；中等强度运动组大鼠腓肠肌肌肉组织、肌外膜、肌纤维基本无显著异常，较为完整，肌纤维纵切面可见周期性横纹(明暗相间带)；高强度运动组鼠腓肠肌少量肌纤维断裂溶解弯曲，余未见异常。见图1。

图1 HE染色腓肠肌观察结果 ×200A：健康对照组；B：模型组；C：低强度运动组；D：中等强度运动组；E：高强度运动组

2.2 蛋白质印记检测大鼠骨骼肌相关凋亡因子水平结果与健康对照组相比，模型组大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，低强度运动组大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.05)；与低强度运动组相比，中等强度运动组大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.05)；与中等强度运动组相比，高强度运动组大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图2、表1。

图2 蛋白质印记检测大鼠骨骼肌相关凋亡因子水平结果

表1 骨骼肌相关凋亡因子水平

2.3 大鼠生化指标检测结果与健康对照组相比，模型组大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)；与模型组相比，低强度运动组大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；与低强度运动组相比，中等强度运动组大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；与中等强度运动组相比，高强度运动组大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠生化指标检测结果

2.4 ELISA法检测大鼠炎症因子结果由表3可以看出，与健康对照组相比，模型组大鼠IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组相比，低强度运动组大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；与低强度运动组相比，中等强度运动组大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；与中等强度运动组相比，高强度运动组大鼠L-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表3 大鼠炎症因子结果

2.5 生物化学方法测定大鼠氧化应激反应相关物质活性与健康对照组相比，模型组大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)；与模型组相比，低强度运动组大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；与低强度运动组相比，中等强度运动组大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；与中等强度运动组相比，高强度运动组大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)。见表4。

表4 氧化应激反应相关物检测结果

2.6 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平与健康对照组相比，模型组大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表达水平升高、GLUT4 mRNA 和蛋白表达水平降低(P<0.05)；与模型组相比，低强度运动组大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表达水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)；与低强度运动组相比，中等强度运动组大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表达水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)；相比中等强度运动组，高强度运动组大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表达水平升高、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图3、表5。

图3 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表达水平

表5 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表达水平

3 讨论

骨骼肌损伤后肌细胞核会固缩、溶解，肌束膜破裂。本研究通过HE染色腓肠肌发现，使用运动疗法治疗后，大鼠腓肠肌肌外膜完整，可见血管及神经；肌束膜包裹肌纤维，肌纤维完整，肌细胞核大小形态未见异常。说明使用运动疗法后，大鼠骨骼肌的损伤得到了有效的缓解。

糖尿病是目前肾脏病主要原因之一，其原因和自由基有密切关系。这些自由基可以促进免疫反应和炎症反应使得患者体内相关炎症反应加剧。目前研究较多的促炎性细胞因子包括：TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等；抗炎性细胞因子则包括：IL-4、IL-10、白介素-1等。同时也会使得糖尿病患者血清中的TC、TG、LDL增多，也会使血压升高，损伤到血管内皮，这也是糖尿病会恶性循环，不断加重病情的原因之一，所以抗氧化对于预防和延缓糖尿病的慢性并发症有重要作用。本研究显示，接受运动疗法后的大鼠体内相关炎症因子IL-6、TNF-α降低，抗炎症因子升高。说明运动疗法可以有效降低大鼠体内的炎症反应，且中等强度的运动疗法效果最佳。朱雪丽 等[11]研究表明：运动疗法可有效地控制微炎症状态，与本研究得出的结论相一致。本研究表明接受运动疗法后的大鼠体内血糖、TC、TG、LDL降低，HDL升高。亢建国[12]的研究表明：糖尿病大鼠血糖与脂代谢具有相关性，且两者相互影响，降低了血脂，糖尿病也得到了改善，与本研究得出的结论相一致。

细胞凋亡是一种在形态学上和坏死完全不同的细胞死亡类型。Caspase家族基因是调控细胞凋亡的重要基因。Caspase 家族中主要调控凋亡的基因包括：Caspase-3和Caspase-9，其中Caspase-9可以裂解促进 proCaspase-3 产生有活性的 Caspase-3。剪切另外的 Caspase 底物，达到引起级联反应促进细胞凋亡。本实验显示，使用运动疗法后大鼠体内的Caspase-3和Caspase-9水平降低，说明大鼠骨骼肌细胞的凋亡受到了抑制，有效保护糖尿病大鼠的骨骼肌。谭小梅[13]的研究表明：降低体内Caspase-3和Caspase-9的水平可以有效抑制体内细胞的凋亡，减少机体的损伤，本研究得出的结论与之相一致。

氧化应激是加重大鼠糖尿病的重要原因之一，其中SOD和MAD含量可反映氧化应激的程度。除了SOD和MAD，LDH的含量也可以反映氧化应激的程度，当细胞损伤LDH会由胞内释放到胞外。本研究发现，使用运动疗法后SOD水平升高、LDH、MAD水平降低，说明大鼠体内氧化受到了抑制，降低了细胞损伤的程度。鞠礼 等[14]研究表明：降低体内过氧化反应可以有效缓解糖尿病症状，本研究得出的结论与之相一致。

糖尿病患者GLUT4的囊泡向胞膜移动，使得患者者血清内GLUT4含量水平会减少。本研究显示，使用运动疗法后大鼠FOXO1 mRNA和蛋白表达水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平升高，说明运动疗法可以调节大鼠血糖、血脂及炎症反应，降低大鼠体内炎症反应可以有效缓解大鼠糖尿病的进展。Armoni et al[15]研究表明：降低FOXO1表达、升高GLUT4可以有效降低炎症反应，本研究得出的结论与之相一致。

综上，运动疗法可以通过升高骨骼肌GLUT4蛋白及mRNA表达水平、降低骨骼肌FOXO1蛋白及mRNA表达水平缓解糖尿病大鼠病理损伤，且中等运动强度效果最佳。