CXCL12调控PI3K/AKT信号通路抑制肝癌细胞hepG2凋亡

汪丹丹，周伟杰，王 雾，蒋梦雅，杨 梅，陈镜宇，魏 伟

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌和胃癌。在世界范围内，每年因HCC死亡的人数超过74.5万，而中国约占5.5%[1-3]。目前，HCC最有效的治疗方法是手术治疗，但对于不能耐受手术、术后复发以及晚期有转移的患者，化疗仍是主要的治疗手段。细胞凋亡是正常机体细胞自主性、有序死亡的过程，而细胞的凋亡抵抗是导致肿瘤化疗效果差的主要原因。CXCL12又被称为SDF-1(stromal cell-derived factor 1)，是可与CXCR4(G蛋白偶联受体)特异性结合的一种趋化因子，不仅可促进肿瘤细胞的迁移，还可以促进细胞存活，抑制细胞凋亡。在子宫内膜癌中，CXCL12与CXCR4作用时可明显减少细胞的凋亡。PI3Kβ属于IA型PI3K，主要由催化亚基p110β和调节亚基p85组成，与肿瘤发生密切相关。有文献表明CXCL12与CXCR4结合后可引起PI3K/AKT的活化[4]，且PI3K/AKT的活化与胃癌、急性髓系白血病等肿瘤细胞凋亡密切相关[5-6]，但CXCL12对肝癌细胞凋亡的影响尚不明确。该研究探讨CXCL12对肝癌细胞hepG2凋亡的影响及其与PI3K/AKT信号的关系，为肝癌细胞的凋亡及机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人肝癌细胞株HepG2购买自中科院上海细胞库。

1.1.2试剂及仪器 鼠单克隆抗体β-actin 和兔单克隆抗体p110β购买自美国Proteintech公司；兔多克隆抗体p85(phospho Y464)购买自英国Abcam公司；兔单克隆抗体p85、兔源AKT及AKT(phospho Ser473)均购买自美国Cell Signaling Technology公司；兔单克隆抗体Bax、兔单克隆抗体Bcl-2均购买自美国Bioworld Technology公司；重组小鼠SDF-1α(CXCL12)购买自美国Peprotech公司；胎牛血清和DMEM均购买自以色列Biological Industries公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购买自上海贝博生物科技有限公司；LY294002购买自美国APExBIO Technology公司；激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将人肝癌HepG2 细胞置于5% CO2、37 ℃ 恒温培养箱中培养，并用含有10%胎牛血清，1%青-链霉素的培养基进行换液、传代。当培养瓶(皿)中细胞密度长至80%左右时开始进行相关实验。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 当细胞培养板中HepG2 细胞密度长至80%左右时，加入100 ng/ml CXCL12、20 μmol/L PI3K抑制剂(LY294002)，作用不同时间后，用不含EDTA的胰酶进行消化，收集细胞，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪进行检测。

1.2.3Western blot法检测PI3K、AKT及凋亡相关蛋白的表达 当细胞培养板中HepG2 细胞密度长至80%左右时，加入100 ng/ml CXCL12作用5 min、20 μmol/L PI3K抑制剂(LY294002)作用1 h，收集细胞，在冰上用细胞裂解液进行裂解，于离心机上11 441 r/min离心15 min，取上清备用。在上清液中加入蛋白上样缓冲液，开水中煮沸9 min使其变性。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭等操作，之后分别加入相应的一抗(β-actin、p110β、p85、p-p85、AKT、p-AKT、Bax和Bcl-2)，4 ℃ 孵育过夜，加入相应二抗于37 ℃ 孵育2 h，通过化学发光成像仪进行结果检测。

1.2.4激光共聚焦法检测凋亡相关蛋白的表达 将消化后的细胞接种在含有无菌载玻片的24孔板，培养待细胞贴壁后，加入CXCL12刺激5 min，加入LY294002作用1 h，用组织固定液对细胞进行固定，5%BSA进行封闭，之后加入相应一抗(Bax或Bcl-2)孵育过夜，二抗室温孵育2 h，DAPI通透5 min，滴加少量防荧光淬灭剂进行封片，最后通过激光共聚焦显微镜进行拍片。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 6.01软件进行统计学分析，多组间差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组之间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL12对HepG2细胞凋亡的影响由图1 A、1B可知，与0 min组(不加CXCL12刺激时)相比，CXCL12(100 ng/ml)作用5、10、15、30、60 min后，hepG2细胞的凋亡比例均减少(F=6.733，P<0.05)，且不同时间点加入CXCL12作用组(实验处理组)与阴性对照组相比，细胞凋亡比例均减少(P=0.024 9)，见图1C。由图1D、1E可知，与空白对照组相比，CXCL12(100 ng/ml)刺激5 min后，hepG2细胞凋亡比例下降(F=80.84，P<0.01)；在100 ng/ml CXCL12的体系中加入PI3K抑制剂(LY294002)时，hepG2细胞的凋亡比例与CXCL12组相比升高(F=80.84，P<0.01)。提示CXCL12可以抑制hepG2细胞凋亡，此作用可能与PI3K活化有关。

2.2 CXCL12对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响与空白对照组相比，CXCL12(100 ng/ml)上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(FWB=48.67、FIF=26.29，P<0.01)；与CXCL12组相比，PI3K抑制剂LY294002下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2A、2B、2E、2G。与空白对照组相比，100 ng/ml CXCL12下调促凋亡蛋白Bax的表达(FWB=24.61、FIF=12.05，P<0.01)；与CXCL12组相比，PI3K抑制剂LY294002上调促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.01)，见图2C、2D、2F、2H。

2.3 CXCL12对PI3K/AKT通路活化的影响与空白对照组相比，100 ng/ml CXCL12可以上调p-p85(F=18.77)和p-AKT(F=18.63)蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.05)；加入PI3K抑制剂LY294002后可以下调p-p85和p-AKT蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3A、3C和3D。与空白对照组相比，100 ng/ml CXCL12不影响p110β、p85及AKT总蛋白的表达(Fp110β=0.05154、Fp85=0.2990、FAKT=2.197，P>0.05)差异无统计学意义；加入PI3K抑制剂LY294002后，不影响p110β、p85及AKT总蛋白的表达，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A、3B。提示CXCL12可以诱导p85和AKT的磷酸化，活化PI3K/AKT通路。

图1 CXCL12对hepG2细胞凋亡的影响

图2 CXCL12(100 ng/ml)对hepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图3 CXCL12(100 ng/ml)对PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，对正常组织的发育与稳态平衡起着重要作用，凋亡功能的紊乱可以促进肿瘤细胞的生长。CXCL12/CXCR4信号与肿瘤细胞的凋亡密切相关。有研究表明，CXCR4在白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌细胞中表达升高[7]；在CXCR4阳性的肿瘤细胞中，CXCL12可以减少无血清培养时肿瘤细胞的凋亡；恶性胶质瘤细胞中，CXCL12激活可以减少喜树碱诱导的细胞凋亡[8]。此外，在非小细胞肺癌中，CXCL12也可通过激活JAK2/STAT3通路抑制顺铂诱导的细胞凋亡[9]。与上述研究结果相一致，该研究结果显示CXCL12可以抑制肝癌细胞hepG2的凋亡。

Bcl-2家族成员是细胞凋亡线粒体途径的重要调节器，其家族成员主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax及Bad等。Bcl-2蛋白作为抗凋亡调节子广泛的参与细胞活动，Bax蛋白是一种促凋亡蛋白，通过与Bcl-2的同源二聚化和异源二聚化作用诱导细胞的死亡。文献[10]报道细胞中Bcl-2蛋白的表达与肿瘤的分化及各种组织病理学高危因素具有显著相关性。肝癌细胞中Bcl-2/Bax比值的升高可使细胞凋亡减少，加速肝癌细胞生长。此外，Bcl-2蛋白表达的增加还与肝癌化疗药物索拉菲尼耐药性有关。该研究结果显示，CXCL12可以上调肝癌细胞hepG2的抗凋亡蛋白Bcl-2水平，下调促凋亡蛋白Bax的水平，这提示CXCL12可以上调Bcl-2/Bax比值进而减少hepG2细胞凋亡。

PI3K是一种广泛表达的重要的磷脂蛋白激酶，在细胞内主要介导G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶信号的转导[11]。当CXCL12与其特异性受体CXCR4结合时可引起下游信号分子PI3K/AKT的活化。研究[12]表明肝癌的生长与PI3K/AKT信号的活化有关，并且该通路在30%～50% 肝癌患者中被激活。Rab31可通过激活PI3K/AKT信号通路上调肝癌细胞Bcl-2/Bax的比值，减少细胞凋亡，进而加速癌细胞的生长；柳穿鱼素可通过抑制 PI3K/AKT信号通路，抑制肝癌细胞活性，引起凋亡；此外，抑制 PI3K/AKT信号通路还可降低肝癌细胞的多药耐药性。本研究结果提示CXCL12可以增加p-p85及p-AKT蛋白的表达，因而诱导PI3K/AKT信号通路的活化，此作用可能与其抑制hepG2细胞凋亡有关。

综上，CXCL12可以上调Bcl-2/Bax比值，抑制hepG2细胞的凋亡，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路的活化有关。CXCL12作为一种多功能的趋化因子，可以参与细胞的迁移、增殖、凋亡及血管生成等过程，其对肿瘤细胞的影响及机制还需要进一步深入研究。