MicroRNA-26b抑制胚胎干细胞的多能性

曹 靓, 金 瑞, 孟祥云,王浩浩，李天立，刘小燕，王康林，吴繁荣, 臧洪梅

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)是胚胎囊胚期内细胞团(inner cell mass, ICM)衍生出的多能细胞，其具有产生人体内所有分化细胞类型的能力[1]。近年来的一些研究阐明了miRNA-26(miR-26)簇(包括miRNA-26a和miRNA-26b)在发育中的作用，包括肌生成、成骨分化、胰腺细胞分化和肌肉分化[2-4]等。所有上述分化的组织或器官是从两个胚层(中胚层和内胚层)分化而来的。因此,该研究探讨miR-26簇在ESCs中对多能性和分化的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物与试剂 DMEM培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、庆大霉素购于美国GIBCO公司；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)购于美国Millipore公司；糖原合成酶激酶3β抑制剂(CHIR99021)、MAPK/ERK激酶抑制剂(PD0325901)购于英国Abcam公司；胰蛋白酶、碘化丙啶购于美国Sigma公司；脂质体2000试剂、Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead cell凋亡试剂盒、Alexa Fluor 488 Annexin V凋亡试剂盒购于美国Invitrogen公司；miRNA模拟物购于上海吉玛制药技术有限公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；蓝色AP染色试剂盒购于美国SBI公司；BCA分析试剂盒购于美国ThermoFisher公司；Sox2、Otc4、 Nanog、GAPDH、α-Tubulin抗体购于英国Abcam公司。

1.1.2主要实验仪器 IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；Tecan Infinite M1000 PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)；超净工作台(美国Thermo公司)；超速离心机、高速冷冻离心机(德国ependorf公司)；Arial Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)；CO2培养箱、超低温冰箱(美国Thermo公司)；7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和分化 在DMEM培养基中添加15% ES等级胎牛血清、55 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、庆大霉素和1 000 U/ml LIF培养小鼠E14Tg2A(E14)细胞。为定期维持细胞株，将糖原合成酶激酶3β抑制剂和MAPK/ERK激酶抑制剂分别加入3 μmol/L和0.2 μmol/L。细胞经胰蛋白酶解离，每2～3 d传代1次。

1.2.2miRNA过表达 将mESCs细胞E14接种于明胶包被12孔，密度为每孔1×105个细胞，第0天用脂质体2000试剂转染50 nmol/L miR-26b的miRNA模拟物(miRNA mimics)。miR-26b模拟物序列(F:uucaaguaauucaggauaggu；R:aaguucauuaaguccuaucca) 。

1.2.3胚状体(embryoid bodies, EB)的形成及诱导分化 采用悬滴法在10 cm培养皿中培养细胞，并在第2天(即分化开始的第0天)去除LIF。采用悬滴法形成EB后，将EB转移到培养皿中进行悬浮培养，最长可达8 d。

1.2.4RNA提取、cDNA合成及实时定量PCR 总RNA按标准程序用TRIzol试剂提取。反转录用标准手册的混合试剂盒进行。在StepOnePlus实时PCR系统上，采用通用SYBR进行定量PCR。以GAPDH作为内参基因，引物序列：Sox2(F:GAACGCCTTCATGGTATGG;R:TCTCGGTCTCGGA CAAAAGT);Oct4(F:AGCTGCTGAAGCAGAAGAG G;R:AGATGGTGGTCTGGCTGAAC);Nanog(F:AAGGCAGCCCTGATTCTTCT;R:ACAGTCCGCATCT TCTGCTT);GAPDH(F: AACTTTGGCATTGTGGAAG G;R:GGATGCAGGGATGATGTTCT)。

1.2.5增殖和细胞周期分析 细胞增殖率采用CCK-8方法检测，将转染miR-26b模拟物和阴性对照物后1、2、3、4 d的细胞加入培养板中培养。再向培养板每孔加入CCK-8溶液。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度并计算细胞增殖率。采用碘化丙啶染色法测定细胞周期，用冰冷PBS冲洗mESCs细胞，加入预冷乙醇后离心，再重悬并加入PI染色液流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.6凋亡试验 采用Annexin V/碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡。转染72 h后，收集5×105个细胞，用冰冷PBS冲洗2次。然后，根据制造商说明书，用Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead cell凋亡试剂盒和Alexa Fluor 488 Annexin V凋亡试剂盒和PI进行流式细胞术染色。未处理细胞作为双重染色阴性对照。

1.2.7碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测采用蓝色AP染色试剂盒，依据正常步骤进行。

1.2.8蛋白免疫印迹法 将细胞培养至80%左右的密度，用PBS洗涤细胞2次，加入蛋白裂解缓冲液，冰上裂解30 min。将细胞刮下，12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA法对蛋白进行定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法将蛋白转移至PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶封闭2 h，用抗体Sox2(1 ∶2 000)、Otc4 (1 ∶1 000)、Nanog(1 ∶1 000)，以α-Tubulin(1 ∶2 000)作为内参对照。用适当的二次抗体(IgG/辣根酶标记，1 ∶10 000)孵育后，用增强化学发光显示信号。

2 结果

2.1 mESCs分化过程中miR-26b的内源性表达课题组首先检测了miR-26前体(pre-miR-26a-1、pre-miR-26a-2和pre-miR-26b)在不同时间点的mESCs(E14Tg2A细胞系)自发分化成胚状体(EB)过程中的表达。在mESCs中，pre-miR-26b表达在miR-26簇群中占大多数(图1)。小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中所有miR-26前体均上调，pre-miR-26b上调幅度最大(约10倍)(图2)。成熟的miR-26b在胚状体(EB)形成过程中第2～6天明显上调(图3)，成熟miR-26b在MEF中的表达水平明显高于mESCs(图4)。

图1 实时荧光定量PCR检测miR-26簇前体在mESCs中的表达

2.2 miR-26b对mESCs增殖的作用课题组利用miRNA mimics在mESCs中上调miR-26b的表达，表明miR-26b过表达能抑制mESCs增殖能力(图5)，并显示miR-26b过表达诱导mESCs阻滞于细胞周期的G1期(图6)。然而，miR-26b并不影响mESCs的细胞凋亡(图7)。

图2 实时荧光定量PCR检测miR-26簇前体在mESCs和MEF中的表达情况

图3 拟胚体形成过程中miR-26b表达

图4 实时荧光定量PCR比较miR-26b在mESCs与MEF中的表达

2.3 miR-26b对mESCs自我更新的作用通过碱性磷酸酶(ALP)染色检测miR-26b在调节mESCs多能性中的作用。ALP染色结果表明miR-26b导致mESCs中ALP活性下降(图8)，显示miR-26b抑制了mESCs的多能性。诱导6 d后，过表达miR-26b的mESCs中多能性标志物(Oct4、Sox2和Nanog)的表达水平均降低(图9、10)。

图5 miR-26b对mESCs增殖的影响

图6 miR-26b对mESCs细胞周期的影响

图7 miR-26b对mESCs细胞凋亡的影响

图8 使用ALP染色试剂盒检测miR-26b对mESCs碱性磷酸酶活性的影响

图9 实时荧光定量PCR检测miR-26b对mESCs中多能性转录因子的mRNA表达的影响

图10 蛋白质印迹分析检测miR-26b对mESCs中3个关键转录因子蛋白表达

2.4 miR-26b对mESCs分化的作用为了进一步评价miR-26b在mESCs分化中的作用，该研究构建了一条稳定的miR-26b表达的mESCs细胞系(图11)。用体外模型研究了miR-26b对mESCs分化的影响。在miR-26b诱导的第4天就观察到了分化的细胞(图12)，其中mESCs开始变平并从细胞群落边缘分离。随后，大多数细胞群落失去了典型的单型形态，形成了具有不同形态的三维结构。

图11 稳定过表达miR-26b mESCs的构建策略

图12 pcDNA-pre-miR-26b mESCs在诱导G418 4 d或6 d后的代表性明亮场区域中细胞形态图像 ×200

3 讨论

该文研究了miR-26b对mESCs多能性的调控作用。miR-26家族共3个成员，即miR-26a-1、miR-26a-2及miR-26b。本研究选择关注miR-26b是因为在mESCs中的miR-26b表达丰度最高，提示miR-26b是mESCs分化过程中miR-26家族的关键成员，并且会随着mESCs的分化逐渐上升。本研究结果表明miR-26b对mESCs的调控作用主要表现在两个方面：首先，mESCs中上调miR-26b就足以阻止自我更新的维持，miR-26b能显著抑制mESCs的多能性及正常的体外增殖，主要表现在对ALP活性的抑制、对三个关键多能性转录因子Sox2、Oct4和Nanog表达的抑制以及对mESCs体外增殖能力的抑制。其中对增殖能力的抑制可能与miR-26b对细胞周期的扰乱作用相关。其次，miR-26b具有促进mESCs的自发分化作用。本研究构建了一条miR-26b稳定过表达的mESCs细胞株，与对照组相比，此细胞株表现出了明显的自发分化的倾向，这提示miR-26b能促进mESCs的自发分化。

近年来的一系列研究[2-4]阐明了miR-26家族在个体发育中的多种作用，包括miR-26在肌生成、成骨分化、胰腺细胞分化和肌肉分化等分化过程中的关键作用。结合本课题的研究结果，一个有趣的共同点是所有上述分化的组织或器官是从两个胚层(中胚层和内胚层)分化而来的。有研究[5]表明中胚层谱系的中胚层或内胚层的形成是分化成中胚层衍生组织或器官的关键步骤。因此，需要进一步探索miR-26b如何通过对内胚层和中胚层靶标调控从而激活内胚层谱系发育，尤其是miR-26b对内胚层谱系成体细胞和组织器官中的作用和机制。本研究结果有助于更好地理解microRNA在mESCs多能性及分化中的作用，有助于阐明如何控制ESCs向特定治疗细胞类型的分化，从而为潜在的细胞治疗提供新策略和新途径。