苯丁酸钠通过下调CLDN4基因DNA甲基化对喉鳞状细胞癌增殖与凋亡的作用研究
2020-08-05卡衣赛尔卡哈尔艾力根阿不都热依木谭元元
卡衣赛尔·卡哈尔 艾力根·阿不都热依木 谭元元
喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是一种侵袭性恶性肿瘤,为喉癌最常见的病理类型,吸烟、饮酒、空气污染和不健康饮食等均是LSCC 发生的决定因素[1~3]。目前,LSCC的治疗方式主要包括放疗、手术并辅以化疗,这些手段能够使大部分患者的病情得到有效控制,但仍有一些患者病情难以控制,例如术后存在组织与器官损伤、复发或转移以及局部及全身并发症等问题[4,5]。目前,LSCC 的发病机制尚不清楚,因此,了解LSCC进展中的分子调节机制将有助于提高LSCC的诊断和治疗水平。苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB)是一种诱导分化剂,对多种肿瘤具有诱导分化、凋亡和杀伤作用,可通过抑制组蛋白脱乙酰基酶来抑制肿瘤细胞的生长,调控多种特定基因的转录水平[6,7]。DNA甲基化可以使DNA构象、DNA稳定性、染色质结构以及 DNA 与蛋白质相互作用的方式均发生改变[8]。越来越多的证据表明,DNA甲基化参与了多种疾病的发生和发展,比如在肿瘤中通过调节DNA 损伤、细胞凋亡及细胞黏附等相关基因来发挥作用[9~11]。但苯丁酸钠对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的生物学行为是否有影响,且能否通过 DNA去甲基化发挥作用,目前尚未有文献报道。因此,本研究通过探究苯丁酸钠对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,并从表观遗传学角度探索相关分子机制,为临床LSCC的诊治提供实验依据。
材料与方法
1.材料:喉鳞状细胞癌细胞 Hep-2 (中国科学院细胞库),苯丁酸钠 (德国 Alexis公司),胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、RPMI1640培养基、胰蛋白酶(美国Invitrogen公司),MTT溶液、DMSO(美国 Sigma公司),Annexin Ⅴ/PI试剂盒(德国 Bendermed公司),免疫荧光染色试剂盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),ECL发光试剂盒(美国 Gibco公司),Taq 酶、RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),DNA提取试剂盒、DNA甲基化试剂盒(美国Thermo Fisher 公司),兔抗CLDN4、鼠抗β-actin、兔抗caspase-3(北京中杉金桥公司),辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(英国 Abcam公司)。
2.细胞培养:喉鳞状细胞癌细胞 Hep-2复苏后,植入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素双抗RPMI1640 培养基中,放在 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,2~3天换液1次,取对数生长期的细胞进行实验。
3.细胞处理与增殖检测:对数生长期Hep-2细胞经 0.25%胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度至5×104/ml并接种于96孔板,每孔100μl,在 37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h后,弃原培养液,加入终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠,以0mmol/L(不加苯丁酸钠)作为对照组,每组设6个复孔。24h后每孔滴加20μl MTT 溶液,继续培养4h,弃去培养液,每孔滴加150μl DMSO,于脱色摇床上振荡10min,使紫蓝色沉淀充分溶解,采用酶标仪测定波长570nm处测吸光度(A)值。
4.细胞周期检测:经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h 后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,并预冷的PBS洗涤2次,加入70%冰乙醇进行固定,固定24h后,弃乙醇,用PBS洗涤2次并重悬细胞,加入含10μg/ml RNase的盐酸缓冲液在37℃下孵育 30min,再加入500μl PI 进行染色,37℃避光孵育30min,进行过300目筛网,通过流式细胞仪进行细胞周期分析。
5.细胞凋亡检测:经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,预冷的PBS洗涤2次,用500μl 1×Binding Buffer重悬各组细胞,加入5μl Annexin Ⅴ-FITC染液与10μl PI染液,室温下避光孵育30min后,立即采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。
6.细胞免疫荧光法检测caspase-3的表达:调整Hep-2细胞密度为 2×105/ml,将灭菌盖玻片吸附于6孔板中,接着将细胞接种于6孔板,在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h后,加入终浓度为4.0mmol/L的苯丁酸钠,0mmol/L苯丁酸钠设为对照组,继续培养24h后弃培养液,使用PBS将盖玻片洗涤3次,4%多聚甲醛固定15min,加入0.2%Triton X-100渗透5min,与3%BSA、0.2%吐温共孵育60min,然后加入兔抗caspase-3(1∶100),4℃孵育过夜,次日PBS 冲洗3次,然后加入Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(1∶750)室温孵育30min。使用DAPI 染细胞核10min,爬片晾干后,封片并在显微镜下观察,进行图像采集。
7.qRT-PCR检测DNMT1、DNMT3a mRNA的表达:用 RNAiso Plus试剂提取经不同浓度的苯丁酸钠处理24h的Hep-2细胞总 RNA,紫外分光光度计检测所提取RNA的纯度与浓度。按照反转录试剂盒说明书步骤反转录合成cDNA,根据 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书检测DNMT1、DNMT3a mRNA水平,以GAPDH 为内参,引物由上海生工生物有限公司合成,DNMT1上游引物:5′-ACCATCACATCTCATTTTGC-3′,下游引物:5′-GGTTTGACTTCGGAGTCTCT-3′;DNMT3a上游引物:5′-TGATGAGCGCACAGAGAGC-3′,下游引物:5′-GTGTTCCAGGTACATTGAG-3′;GAPDH上游引物:5′-TGGGCATCAATGGATTTGGCT-3′,下游引物:5′-ACCATGTATTCGGGTCAT-3′。反应条件:95℃预变性3min,95℃变性20s,62℃退火15s,72℃延伸45s,一共循环40次,实验重复3次。采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。
8.Western blot法检测CLDN4 蛋白的表达:收集经不同浓度的苯丁酸钠处理24h的Hep-2细胞,在各组细胞中加入RIPA裂解液,提取总蛋白,Bradford法对提取蛋白进行定量。取20μg蛋白上样进行10% 的SDS-PAGE凝胶电泳,将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h,TBST洗膜3次,加入兔抗CLDN4 (1∶1000)与鼠抗β-actin (1∶1000)为第一抗体,置于4℃下孵育过夜,次日TBST洗膜3次,并加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗 (1∶5000)常温孵育2h,TBST再次洗膜,滴加ECL发光液进行显色,使用凝胶成像系统对其曝光拍照,再用Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。
9.甲基化特异性 PCR:(1)按照DNA提取试剂盒说明书步骤进行操作,提取不同浓度苯丁酸钠处理的Hep-2细胞的DNA。将300ng待测样品 DNA用 DDW稀释至终体积45μl,加入5μl Methyl SEQrTMDenaturation缓冲液,37℃孵育15min, 接着加入100μl reconstituted Methyl SEQrTM溶液,50℃避光孵育16h。将Methyl SEQrTM吸附柱放置在回收管内,加入混合液后4000r/min离心15min,弃废液,ddH2O 冲洗2次,再次4000r/min离心15min,弃上层液,加入350μl的 NaOH溶液继续孵育5min,4000r/min离心15min,弃上层液,再次用ddH2O 冲洗,之后离心处理弃上层液,在吸附柱中心滴加50μl TE缓冲液,室温静置 5min,4000r/min离心2min,收集液体。(2)根据CLDN4基因序列信息,利用 Methyl Primer Express v1.0软件设计两对引物,一对为甲基化引物(M):上游引物:5′-CTACCGATAAAAACCGTCACG-3′,下游引物:5′-GTGTATTTTGCGAACGTTAAGTTC-3′;另一对为非甲基化引物(U):上游引物:5′-AATATTACTACCAATAAAAACCATCACAC-3′,下游引物:5′-TGTATTTTGTGAATGTTAAGTTTGT-3′。以修饰后DNA为模板,用两对引物分别进行扩增。PCR扩增体系包括:修饰后DNA模板1μl,上、下游引物(10mmol/L)各1μl,10×PCR Buffer 2.5μl,Taq 酶 0.5μl, ddH2O补至25μl。扩增条件为:95℃ 3min;95℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 1min,共35个循环;72℃延伸10min。反应结束后,PCR 产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
结 果
1.苯丁酸钠对 Hep-2细胞增殖的影响:经0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后,MTT检测细胞增殖情况。与对照组(0mmol/L)比较,不同浓度苯丁酸钠对 Hep-2细胞的增殖均有抑制作用,且细胞增殖抑制率随苯丁酸钠浓度增加而升高(P<0.01),即呈剂量依赖性,详见图1。
2.苯丁酸钠对 Hep-2细胞周期的影响:通过流式细胞仪检测经不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h细胞周期的变化,与对照组(0mmol/L)比较,不同浓度苯丁酸钠处理 Hep-2细胞后,G0/G1期细胞比例显著增加,而S期细胞比例显著下降(P<0.01,图2)。
3.苯丁酸钠对 Hep-2细胞凋亡的影响:用流式细胞仪检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h的凋亡百分率。与对照组(0mmol/L)比较,随着苯丁酸钠浓度增大,细胞凋亡率逐渐增高(P<0.01),详见图3。
4.苯丁酸钠对 Hep-2细胞caspase-3 表达的影响:Hep-2细胞用4.0mmol/L的苯丁酸钠处理后,细胞免疫荧光实验检测caspase-3 表达,对照组(0mmol/L)的Hep-2细胞中caspase-3无表达,4.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后,caspase-3在细胞中表达显著增强(图4)。
5.苯丁酸钠对 Hep-2细胞CLDN4蛋白表达的影响:利用 Western blot法检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞 24h后CLDN4蛋白表达情况,对照组(0mmol/L)中CLDN4蛋白几乎不表达,经过苯丁酸钠处理后,CLDN4蛋白开始表达,且CLDN4 表达水平随苯丁酸钠浓度增加而升高,呈剂量依赖性(P<0.01),详见图5。
6.苯丁酸钠对 Hep-2细胞DNMT1、DNMT3a mRNA表达的影响:采用qRT-PCR检测不同浓度的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后,细胞甲基转移酶 DNMT1、DNMT3a mRNA的表达。与对照组(0mmol/L)比较,不同浓度苯丁酸钠处理后,细胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA的表达显著下调,且呈剂量依赖性(P<0.01),详见图6。
7.苯丁酸钠对 Hep-2细胞CLDN4基因甲基化的影响:2%琼脂糖凝胶进行电泳,对照组(0mmol/L)Hep-2细胞甲基化和非甲基化都可扩增出特异性亮度条带,说明CLDN4基因均表达。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L的苯丁酸钠处理Hep-2细胞24h后,随着苯丁酸钠浓度增加,非甲基化CLDN4的表达增加,并抑制了甲基化CLDN4 的表达,当苯丁酸钠浓度达到4.0mmol/L与8.0mmol/L时,甲基化CLDN4几乎不表达,详见图7。
讨 论
喉头在人体内具有重要的生理功能,如发声、呼吸、粘连、嗅觉和味觉等,LSCC严重影响了喉头的正常功能,约占所有喉头恶性肿瘤的85%~90%,已成为全世界常见的第11大癌症类型[3]。由于大多数LSCC患者在诊断时已处于晚期且致死率较高,因此,探索LSCC的分子机制并寻找新靶点与新药物将会有助于提高LSCC的综合诊治水平。
苯丁酸钠作为一种低分子量脂肪酸,可协助基因翻译后修饰与折叠,能够抑制淋巴瘤、肝癌、胃癌、脑肿瘤等一些恶性肿瘤的进展[7,12]。Paskova等[13]研究发现,苯丁酸钠可以降低前列腺癌细胞LNCap与C4-2的活力,并降低其黏附力。刘奇等[14]通过不同浓度苯丁酸钠作用胃癌细胞株 SGC-7901后发现,细胞生长和分化能力明显受到抑制,G0/G1期明显增加,且呈时间和剂量依赖性。本研究结果显示,苯丁酸钠能抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖,使细胞G0/G1期阻滞,并诱导细胞凋亡,这与苯丁酸钠作用其他肿瘤细胞的结果是一致的。
CLDN4是紧密连接蛋白的重要组成部分,具有抑制肿瘤发生与发展的作用,例如CLDN4 可有效地抑制胰腺癌细胞侵袭和转移[15,16]。然而,CLDNs在肿瘤组织中的表达受多种调节机制的影响,研究表明,肿瘤进程与DNA甲基化密切相关[17]。近年来,DNA甲基化对肿瘤中CLDNs表达的调节作用已成为研究热点。本研究通过甲基化特异性 PCR检测CLDN4基因甲基化水平,结果显示Hep-2细胞中CLDN4基因呈高甲基化状态,经过苯丁酸钠处理后可明显降低Hep-2细胞CLDN4的甲基化程度,促进 CLDN4基因的去甲基化,进而促进 CLDN4蛋白的表达。
此外,DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNMT)催化,其中,DNMT1被认为是一种维持性DNA甲基转移酶,主要维持CpG甲基化,参与胚胎发育、细胞存活等进程[18]。DNMT3a是从头甲基转移酶,通常参与胚胎发育过程中DNA甲基化模式的建立[19]。总之,DNMT1和DNMT3a共同参与并维持DNA甲基化。本研究中经过钠处理Hep-2细胞后,细胞中 DNMT1、DNMT3a mRNA表达水平被明显下调。这提示苯丁酸钠可能通过抑制DNA甲基转移酶促进 CLDN4基因的去甲基化,进而抑制Hep-2细胞的增殖并诱导其凋亡,从而发挥抗肿瘤的作用。因此,苯丁酸钠是一种有潜力的去甲基化生物制剂以及LSCC诊治的待选药物,但其详细机制仍需要进一步深入研究。