锌指蛋白ZBTB20原核重组表达与纯化体系的优化

苏 凯 谢志芳 张 海 章卫平

锌指蛋白ZBTB20是一种最初从人树突状细胞中克隆的ZBTB锌指蛋白亚家族成员，又称DPZF、ZNF288或HOF[1]。其N端含有由约120个氨基酸组成的BTB/POZ结构域，可介导蛋白间的结合；C端含有5个C2H2锌指结构，通常认为具有DNA结合功能，参与调控靶基因的转录。ZBTB20基因在进化中高度保守，在小鼠和人类中的同源性可达到97%。由于翻译起始点的不同，人和小鼠ZBTB20蛋白有L和S两种亚型，分别由741和668个氨基酸残基组成。其中，S亚型缺少L亚型N端的73个氨基酸残基，其余部分的氨基酸序列完全相同[2]。

本研究建立了ZBTB20全身性和多种组织特异性基因敲除小鼠模型，研究发现该分子在器官发育和糖脂代谢稳态中发挥关键作用。例如，ZBTB20对大脑海马CA1神经元、垂体催乳素细胞、背根神经节伤害感受性神经元和肥大软骨细胞的细胞命运或终末分化起决定性作用，在肝脏、胰岛和内分泌系统等多个器官和系统中具有重要的生理学功能[3～11]。该分子主要具有转录抑制作用，对某些基因也可能具有转录激活作用，例如，胰腺内分泌细胞中的ZBTB20通过对果糖-1,6-二磷酸酶同工酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1，Fbp1)的转录发挥直接抑制作用来调控胰岛素分泌[3]；ZBTB20在体内外均可直接结合甲胎蛋白(alpha fetoprotein，APF)启动子并抑制该基因的表达，是调控肝脏AFP基因出生后沉默的关键转录抑制因子[4]。另外，ZBTB20可直接结合垂体催乳素(prolactin，Prl)基因的启动子区并参与其转录激活，从而调控腺垂体催乳素细胞的终末分化[5]。然而，目前对于ZBTB20发挥转录调控的共作用分子及其具体机制还不清楚。

为鉴定分析ZBTB20蛋白的共作用分子及作用机制，本研究拟利用大肠杆菌的谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase, GST)融合蛋白表达系统，表达并纯化制备全长ZBTB20及其截短体的GST融合蛋白。笔者所在实验室曾利用常规的诱导和裂解条件，成功表达并纯化了该蛋白锌指区(573～741aa)的GST融合蛋白，并用于抗体制备和EMSA实验[4,12]。然而，试图用相同的实验体系表达全长ZBTB20的GST融合蛋白时，发现其存在于包涵体中，很难溶解和纯化。鉴于GST融合蛋白的表达效率及溶解性受到蛋白本身的结构以及大肠杆菌诱导表达时的温度、pH值等多种因素的影响，本研究从促进蛋白正确折叠和溶解的角度，对ZBTB20的GST融合蛋白表达与纯化条件进行一系列优化，成功获得具有生物学功能的可溶性融合蛋白，为筛选鉴定ZBTB20的共作用分子奠定实验基础。

材料与方法

1.材料：大肠杆菌BL21(#GP0718)购于天根生化科技(北京)有限公司；GST·Bind 纯化试剂盒(#70794-3REF)购于美国Novagen公司；核酸酶(Benzonase，#20125ES60)购于上海Yeasen公司；蛋白酶抑制剂(#4693132001)购于瑞士Roche公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT，#BL20161)购于德国Merck公司；乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P 40，NP-40，#BL-SJ-0502)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF，#BL-SJ-0557)购于上海博光公司；考马斯亮蓝染色液(#ISB1L)购于英国Expedeon公司；S220超声仪购于美国Covaris公司。ZBTB20及其截短体的GST融合表达质粒由本实验室前期构建保存，表达载体为pGEX-4T-1，质粒中插入的目的片段的结构示意图详见图1。

2.全长ZBTB20-GST融合蛋白诱导表达方法的优化：将经测序确认的pGEX-ZBTB20表达质粒转化BL21感受态细胞，接种单克隆菌落至LB培养液中，37℃振荡培养16h。将培养后的菌液1∶50接种于50ml的SOC培养液中，培养至A6000.6～0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导表达。分别采用两种诱导方案，一种是37℃诱导表达3h，另一种是20℃诱导表达6h。最后通过离心法分别收集细菌。

3.蛋白裂解：用Bugbuster裂解液(来自GST·Bind 纯化试剂盒，并另添加核酸酶Benzonase)重悬细菌沉淀，在25℃孵育30min后，4℃离心(16000×g)20min，收集上清,记为上清-1，其中含有可溶性蛋白；含有不可溶蛋白的沉淀部分记为沉淀-1(其中包含包涵体)。将含有包涵体的沉淀用包涵体裂解液[含有1mmol/L EDTA、20mmol/L DTT、1% NP-40、0.2% 十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)及蛋白酶抑制剂的PBS溶液]进行重悬，然后进行超声处理8次至液体澄清(超声仪的参数设置如下：最高入射功率为140W，工作系数为20%，每次脉冲周期为200，持续时间为30s，水温为4℃)，在4℃摇晃孵育4h后，再次离心(参数同上)后收集上清作为上清-2，依然不可溶的沉淀用8mmol/L的尿素裂解液彻底裂解后作为沉淀-2(图2)。收集各组成分后通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行检测以观察裂解效率。

4.蛋白纯化：根据融合蛋白溶解性的不同选取上清-1或者上清-2进行蛋白纯化。若目的蛋白主要存在于上清-1中，可直接按照GST·Bind 纯化试剂盒中的纯化步骤进行操作。若目的蛋白主要存在于上清-2中(为包涵体裂解后的上清)，则用优化后的稀释缓冲液(含有1mmol/L EDTA、20mmol/L DTT、1%NP-40及蛋白酶抑制剂的PBS溶液)、结合缓冲液(含有1mmol/L EDTA、20mmol/L DTT、1% NP-40、0.07% Sarkosyl、1mmol/L PMSF的PBS溶液)和洗脱缓冲液(来自GST·Bind 纯化试剂盒，另添加蛋白酶抑制剂和终浓度为20mmol/L的DTT)进行纯化。首先，用稀释缓冲液将上清-2进行稀释，使得该溶液中的Sarkosyl浓度稀释至0.07%，然后将该溶液加入已预洗完毕的含GST·Bind resin的纯化柱中，在25℃的环境温度中待蛋白溶液缓缓流过纯化柱，同时收集结合后样品，然后用结合缓冲液(用量为所用GST·Bind resin体积的5倍)洗纯化柱，最后用洗脱缓冲液洗脱GST融合蛋白。收集各组成分后通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色进行检测。

结 果

1.全长ZBTB20-GST融合蛋白的重组表达：将pGEX-ZBTB20表达质粒导入蛋白酶缺陷的宿主菌BL21，在37℃条件下用0.1mmol/L IPTG诱导表达1～3h。收集菌体后经尿素裂解液彻底裂解、SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，以观察表达效率。与诱导前样品比较，37℃诱导表达1～3h，在130kDa下方(为全长ZBTB20-GST的预测目标条带位置)均能看到明显的条带，而且，培养时间越长该条带颜色越深，说明该融合蛋白的表达量随着培养时间的延长而增加，提示所获得的菌株能高效表达全长ZBTB20-GST融合蛋白(图3A)。

2.全长ZBTB20-GST融合蛋白的诱导与裂解条件的优化：为了进一步纯化全长ZBTB20-GST融合蛋白，笔者首先用常规的Bugbuster裂解液对37℃条件下诱导表达的菌体进行破壁裂解，离心后将上清(上清-1)和沉淀(沉淀-1)分别进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。结果显示，全长ZBTB20-GST融合蛋白主要存在于沉淀中,表明该条件下诱导表达的ZBTB20-GST融合蛋白主要以不可溶的形式存在于包涵体中。然后用包涵体裂解液处理沉淀，并辅以超声处理助其溶解，发现该融合蛋白依然主要存在于沉淀中(沉淀-2，图3B)，而上清中(上清-2)很少，无法进行后续亲和纯化。为了获得足够量的可溶性ZBTB20-GST融合表达蛋白，对诱导表达的条件进行优化。发现将诱导表达的温度降低至20℃，同时延长IPTG诱导表达时间至6h，虽然ZBTB20-GST融合蛋白依然存在于包涵体沉淀中，但经包涵体裂解液处理后，在上清-2的靶蛋白目标条带位置可以看到明显的条带，说明低温诱导表达获得的ZBTB20-GST融合蛋白可以被包涵体裂解液部分溶解，可用于后续的纯化(图3C)。

3.全长ZBTB20-GST融合蛋白的纯化：为了能纯化包涵体裂解上清中的ZBTB20-GST融合蛋白，将上清中的Sarkosyl浓度稀释至0.07%。通过比较过柱前后上清中ZBTB20-GST蛋白量，可以发现过柱后的上清中ZBTB20-GST蛋白量比过柱前减少，而且柱子经洗脱后可得到比较纯的ZBTB20-GST融合蛋白。说明优化后的方法能成功将上清中的融合蛋白纯化下来(图4)。

4.ZBTB20截短体-GST融合蛋白的表达纯化：对不同长段的ZBTB20截短体-GST分别进行诱导表达和纯化，发现随着截短体长度的缩短，重组蛋白的溶解性增加。ZBTB20C-GST 含该蛋白C端531～741位氨基酸，包含有5个锌指结构(图1)，该截短体融合蛋白虽然也主要以包涵体的形式表达，但几乎可被包涵体裂解液完全溶解在上清中(上清-2，图5A)。另一更短的截断体ZBTB20F1-GST融合蛋白只含有单个锌指区(长度为21个氨基酸残基)，主要以可溶性形式表达，只需用Bugbuster裂解后按试剂盒方法纯化即可(图5B)。

讨 论

本研究对全长ZBTB20-GST融合蛋白的诱导表达方法和纯化条件进行了优化，成功获得了纯度较高的可溶性目标蛋白。包涵体的形成与复性一直以来都是蛋白原核表达纯化中的难题，针对不同的融合蛋白，摸索出合适的诱导温度和诱导时间对于后续的纯化和功能研究至关重要。在37℃环境中进行诱导表达，得到的融合蛋白虽然多，但过快的蛋白合成速度会使得蛋白没有充足的时间进行正确折叠而以溶解性较低的包涵体形式存在，所以需要适当牺牲表达速度来保证蛋白的可溶性[13]。本研究采用20℃诱导表达6h的方法，成功获得足够的能被包涵体裂解液裂解的融合蛋白。

另一方面，为了提高包涵体中融合蛋白的溶解性，需要选择合适的裂解液；用8mmol/L尿素裂解液或者含高浓度SDS的裂解液可以完全裂解包涵体，但这类强变性条件使得融合蛋白彻底变性，只适合用于SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，不适合后续的纯化和蛋白功能研究。本研究选用含0.2% Sarkosyl的包涵体裂解液对包涵体进行裂解取得较好效果。Sarkosyl是一种较强的阴离子去垢剂，可以溶解除细菌外膜蛋白以外的包涵体，而且低浓度的Sarkosyl具有稳定蛋白质的作用，可以保持蛋白质的活性[14]。此外，为了进一步增加包涵体中融合蛋白的溶解度，本研究还进行了温和的超声处理，可能通过机械性地降低蛋白的凝聚程度而促进融合蛋白在裂解液中的溶解。

为了纯化溶解在包涵体裂解液中的融合蛋白，本研究对结合缓冲液进行了优化。最重要的是将Sarkosyl的浓度降低至0.07%。高浓度的Sarkosyl有利于蛋白的裂解，不利于蛋白之间的相互结合。有文献报道，当Sarkosyl的浓度降低至0.07%左右时对抗原抗体结合的影响比较小，随着浓度的提高，会明显抑制抗原抗体的结合效率[15]。本研究的纯化体系是利用GST与还原型谷胱甘肽的特异性结合原理而达到纯化目的，Sarkosyl作为一种较强的阴离子去垢剂同样会对这种结合作用产生负面影响。所以，笔者一方面将结合缓冲液中的Sarkosyl的浓度降低至0.07%，以降低该分子对GST与还原型谷胱甘肽珠子的结合作用的负面影响。另一方面，还在结合缓冲液中加入了1% NP-40。NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，有文献报道，其浓度在2%以下不会干扰抗原抗体的结合，还可能部分减弱Sarkosyl对分子间相互结合的负面影响，同时也有利于降低非特异性结合。

综上所述，本实验通过优化融合蛋白的诱导条件、包涵体的裂解方法和纯化方法，成功纯化得到足够的全长ZBTB20-GST融合蛋白，为体外研究ZBTB20相互作用分子及其机制奠定基础，同时优化方法还对其他GST融合蛋白的诱导表达和纯化具有借鉴作用。